遼寧堿蓬CMO啟動(dòng)子酵母單雜交文庫(kù)鑒定及SlASR基因研究.pdf

1、分類號(hào)：學(xué)校代碼：10165密級(jí)：學(xué)號(hào)：201111200碩士學(xué)位論文遼寧堿蓬CMO啟動(dòng)子酵母單雜交文庫(kù)鑒定及SlASR基因研究2014年05月作者姓名：胡玉鑫學(xué)科、專業(yè)：細(xì)胞生物學(xué)研究方向：抗逆基因表達(dá)調(diào)控導(dǎo)師姓名：李秋莉教授遼寧師范大學(xué)碩士學(xué)位論文-I-摘要甜菜堿是生物體內(nèi)一類小分子滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在植物受到非生物脅迫時(shí)起著重要的作用。膽堿單加氧酶（Cholinemonooxygenase，CMO）是植物甜菜堿合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶，CM

2、O基因的表達(dá)受其啟動(dòng)子及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。分離、鑒定與CMO基因啟動(dòng)子上的順式作用元件相互結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)分析植物的抗逆機(jī)制是十分重要的。本論文通過(guò)篩選酵母單雜交文庫(kù)，得到了可能與CMO啟動(dòng)子區(qū)段中Salt/droughtresponsiveelement功能元件相互結(jié)合的蛋白質(zhì)，獲得了編碼這些蛋白的基因EST序列，選取SlASR基因進(jìn)行功能研究，主要結(jié)果如下：通過(guò)酵母單雜交文庫(kù)的篩選，得到了24個(gè)與Salt/droughtresp

3、onsiveelement相互作用的蛋白質(zhì)的編碼基因EST序列。通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，14個(gè)EST序列可以通過(guò)同源基因來(lái)推斷基因功能，其中8個(gè)與脅迫相關(guān)，選取與ABA、脅迫、成熟相關(guān)的SlASREST（653bp）進(jìn)行研究。根據(jù)SlASREST序列，RACE技術(shù)獲得876bpSlASR基因cDNA序列，其中開(kāi)放閱讀框（ORF）714bp，編碼237個(gè)氨基酸。序列分析表明該基因具有ABA_WDS保守結(jié)構(gòu)域,屬于ASR基因家族。對(duì)該基因編

4、碼蛋白的分子量、理論等電點(diǎn)、跨膜結(jié)構(gòu)、磷酸化位點(diǎn)、亞細(xì)胞定位和折疊特征進(jìn)行了預(yù)測(cè)。將該序列提交到GenBank后獲得登錄號(hào)KC460335。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析顯示，非脅迫條件下，SlASR基因在遼寧堿蓬葉、莖、根中均有表達(dá)。在葉中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于其在根、莖中的表達(dá)；SlASR基因在遼寧堿蓬葉中的表達(dá)受高鹽、低溫、干旱和ABA脅迫誘導(dǎo)?；驑尫ㄞD(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)表明，GFP-SlASR融合蛋白特異性定位在細(xì)胞核中。酵母轉(zhuǎn)錄

5、激活實(shí)驗(yàn)證明在酵母株系A(chǔ)H109體內(nèi)，SlASR無(wú)轉(zhuǎn)錄激活活性。盡管SlASR無(wú)轉(zhuǎn)錄激活活性，但是其定位于細(xì)胞核，并且能和Salt/droughtresponsiveelement相結(jié)合，因此SlASR是能夠與DNA直接結(jié)合的核蛋白，可能通過(guò)其他核蛋白的幫助來(lái)行使轉(zhuǎn)錄激活作用。蘸花法轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得了SlASR基因超量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因擬南芥株系。超表達(dá)SlASR基因的轉(zhuǎn)基因株系在外部形態(tài)上沒(méi)有發(fā)生變化，其對(duì)干旱、低溫及高鹽脅迫的耐受能力顯著