三株大型真菌的發(fā)酵條件優(yōu)化及其胞外多糖的結構與功能研究.pdf

1、關于真菌多糖的研究方興未艾，部分珍稀的野生大型真菌不斷有相關研究與報道，銀杏多孔菌(Fomitopsis sp.)、小孔硬孔菌[Rigidoporus microporus(Fr.)Overh.]、大肉齒耳菌(Steccherinum septentrionale(Fr.)Bank.)三株野生大型真菌，在液體發(fā)酵及胞外多糖結構與功能研究方面，尚未有相關報道。本課題以這三株大型真菌為研究對象，在分子生物學水平上對采集于長白山山脈的銀杏多孔

2、菌進行了菌株鑒定，并對三株真菌進行了搖瓶與液體深層發(fā)酵實驗，通過液體深層發(fā)酵培養(yǎng)，收集了胞外粗多糖，純化處理得到精制多糖，通過傅里葉紅外變換、氣相色譜、熱重、剛果紅及特異性粘度實驗等檢測手段，預測了多糖分子的結構與組成，通過DPPH法、鄰二氮菲法進行了胞外多糖抗氧化實驗。結果如下:
　　1、種屬鑒定
　　采用ITS技術，對銀杏多孔菌進行分子生物學鑒定。將獲得的ITS基因序列提交至NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.

3、nlm.nih.gov/)，獲得基因序列號:KF279536。通過對包含銀杏多孔菌在內的這些ITS序列進行初步比對，并構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果證實該大型真菌屬于擬層孔菌屬。
　　2、液體深層發(fā)酵實驗
　　搖瓶發(fā)酵，確定了三株大型真菌最優(yōu)發(fā)酵條件，銀杏多孔菌（Ginkgo polypores）:周期8d，乳糖、酵母浸粉分別作為C源、N源;小孔硬孔菌[Rigidoporus microporus(Fr.)Overh.]:周期6d、C

4、源為乳糖、N源為胰蛋白胨;大肉齒耳菌(Steccherinum septentrionale(Fr.)Bank.):周期8d、麥芽糖與大豆粉分別為C、N源。在此基礎上，通過5L三聯(lián)罐液體深層發(fā)酵實驗，初步探索了三株大型真菌在液體發(fā)酵條件下胞外多糖與菌絲干重、顯微形態(tài)特征及流變學特性，結果發(fā)現(xiàn)菌絲球形態(tài)學與流變學存在相互影響、相互制約的關系。
　　3、胞外多糖的純化、結構與功能研究
　　通過過濾、醇沉收集胞外粗多糖，再經(jīng)Sev

5、age法除蛋白、Sepharose CL-6B凝膠柱層析，獲得精多糖。(1)紅外分析表明，除了典型的多糖吸收峰外，銀杏多孔菌胞外多糖存在吡喃環(huán)和羧酸基團;小孔硬孔菌胞外多糖存在α和β糖苷鍵;大肉齒耳菌存在β-葡萄糖醛酸及甘露糖結構。(2)氣相分析表明，銀杏多孔菌胞外多糖主要由吡喃甘露糖(59.32％)、吡喃半乳糖(12.71％)和葡萄糖(11.02％)組成;小孔硬孔菌單糖組成為葡萄糖(50.09％)、甘露糖(28.53％)和半乳糖(15

6、.83％);大肉齒耳菌胞外多糖主要由葡萄糖組成，占比98.05％。(3)通過熱重分析實驗可知，三株大型真菌胞外多糖在低于101℃、112.11℃和132.49℃的溫度下，能較好的保持生物學活性。(4)剛果紅實驗，小孔硬孔菌胞外多糖可以與剛果紅形成絡合物，證明其高級結構中存在三股螺旋的無規(guī)線團鏈構象，而銀杏多孔菌與大肉齒耳菌胞外多糖不存在這一結構。(5)烏氏粘度計測定胞外多糖的特異性粘度，發(fā)現(xiàn)銀杏多孔菌、小孔硬孔菌及大肉齒耳菌胞外多糖的特

7、異性粘度分別為274mL/g、334mL/g及543mL/g。(6)體外抗氧化實驗表明，三種大型真菌胞外多糖都有一定的抗氧化活性，但差異也較顯著，銀杏多孔菌胞外多糖對DPPH清除率較低，多糖濃度為2.5mg/mL時，DPPH清除率為10.02％，但對·OH自由基清除率較高，在4mg/mL時·OH自由基清除率達到37.99％;小孔硬孔菌對DPPH與·OH自由基清除率均較低，分別為8.75％和4.37％;大肉齒耳菌胞外多糖對DPPH、·OH