薩氏海鞘多肽CS5931的發(fā)酵和純化條件優(yōu)化及其抗腫瘤活性研究.pdf

1、玻璃海鞘廣泛分布于山東沿海地區(qū)，曾是水產(chǎn)養(yǎng)殖的大敵，但它是發(fā)育與進化生物學(xué)研究的重要生物，且近年來研究發(fā)現(xiàn)它具有抗腫瘤、抗病毒、抗微生物、免疫調(diào)節(jié)以及生物催化等作用，因而引起人們廣泛關(guān)注。玻璃海鞘具有廣泛的應(yīng)用價值，因此被《Science》雜志稱為生物學(xué)研究的后起之秀，具有良好的應(yīng)用前景。
　　從薩氏海鞘（Ciona savignyi）中分離出的一種新型多肽CS5931具有顯著的抗腫瘤活性，N-末端序列分析發(fā)現(xiàn)，CS5931與人顆

2、粒體蛋白（granulin，GRN）有同源性。本課題組已成功通過大腸桿菌原核表達系統(tǒng)表達了重組薩氏海鞘多肽CS5931，其同樣具有顯著的抗腫瘤活性。
　　本研究以重組表達薩氏海鞘多肽CS5931的大腸桿菌BL21(DE3)/pET21a-CS5931為考察菌株，從IPTG的濃度、IPTG添加時間、誘導(dǎo)時間、接種量、裝液量、培養(yǎng)溫度等方面優(yōu)化表達體系的發(fā)酵條件。利用PB實驗篩選出對發(fā)酵條件影響最大的3個因素，結(jié)合單因素實驗設(shè)計響應(yīng)面

3、實驗，最后通過CCD實驗確定3個主要因素的最優(yōu)值。發(fā)酵條件優(yōu)化后表達收率達0.703g/L，與優(yōu)化前相比提高了2.01倍。
　　將發(fā)酵生產(chǎn)的菌種超聲破碎離心處理后，利用AKTA-Purifier過鎳柱進行分離純化。改變分離純化過程中的緩沖液種類、高鹽濃度，變復(fù)性過程中的變復(fù)性方式、緩沖液種類等條件，達到優(yōu)化目的。優(yōu)化后蛋白收率達30％，基本完成預(yù)期目標。
　　通過MTT法評價了重組薩氏海鞘多肽CS5931對腫瘤細胞生長的抑制

4、作用。結(jié)果表明，CS5931對人結(jié)腸癌細胞HCT116、人胰腺癌細胞Panc28、人大細胞肺癌細胞NCI-H460、人肝癌細胞BEL-7402等均有增殖抑制作用，IC50值分別為1.41、2.04、4.28、11.71μM，而其對正常細胞HFL1的抑制作用比腫瘤細胞弱，其IC50值約為28μM。
　　通過對重組薩氏海鞘多肽CS5931的發(fā)酵條件及分離純化條件的優(yōu)化，得到了較高的多肽收率，并且重組多肽對腫瘤細胞具有較好的抑制活性，為