皂角刺總黃酮的提取、純化及抗腫瘤活性研究.pdf

1、目的:以有機溶劑乙醇回流提取中藥皂角刺中的總黃酮成分,并上聚酰胺柱進行純化,得到兩批含量不同的總黃酮樣品。以CCK-8法測定皂角刺總黃酮粗提物及純化后對體外四種腫瘤細胞增殖作用的影響,旨在為課題后期皂角刺總黃酮的進一步分離及制備單體的研究提供科學的實驗依據(jù)。
　　 方法:在前期實驗研究的基礎上,以最佳的提取工藝條件回流提取皂角刺中的黃酮類組分,然后對皂角刺總黃酮粗提物的純化進行研究,得出最佳精制條件。根據(jù)顏色反應及紫外光譜定性產(chǎn)

2、品中黃酮類化合物具有黃酮的吸收光譜特征,可以確定產(chǎn)品可能屬黃酮類。對粗提取物和純化后的皂角刺總黃酮進行紫外-可見分光光度法含量測定。最后分別選用K562人白血病細胞株,Bel-7402人肝癌細胞株,SMMC-7721人肝癌細胞株,HCT116人結(jié)腸癌細胞株,體外培養(yǎng)于含10％胎牛血清的RPM11640培養(yǎng)基,置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中。取對數(shù)生長期的細胞,調(diào)整合適的細胞懸液密度,分別接種于96孔培養(yǎng)板,用不同濃度(250、125、6

3、2.5、31.25、15.625)μg·mL-1的皂角刺總黃酮粗提物及純化后分別處理48小時后,以CCK-8法測定皂角刺總黃酮粗提物及純化后對體外腫瘤細胞增殖作用的影響,并對2組間數(shù)據(jù)進行t檢驗,分析兩者是否存在統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果:聚酰胺純化的最佳條件為:上樣濃度1mg·mL-1,上樣體積1.5BV,40％的乙醇4.5BV(床體積)洗脫,洗脫流速3BV／h。采用加熱回流提取-聚酰胺純化的工藝路線,此條件下得到的洗脫液通過真

4、空減壓干燥,得到黃褐色的總黃酮粉末。紫外-可見分光光度法(比色法)含量測定達到58.84％,經(jīng)聚酰胺二次吸附、洗脫后,粗制皂角刺總黃酮產(chǎn)品的純度提高到81.84％,達到較好的純化效果。以蘆丁為標準品,建立了標準曲線的回歸方程為y=1.1939x-0.0068,r=0.9999,線性關(guān)系在0.053—0.848mg范圍內(nèi)。總黃酮平均回收率為96.7％,RSD為2.02％(n=6)。皂角刺總黃酮對各腫瘤細胞增殖的抑制作用隨著濃度的增加而增強

5、,呈現(xiàn)出較好的量效關(guān)系。皂角刺總黃酮純化后(含量81.84％)對K562、HCT116、SMMC-7721、Bel-7402的IC50分別為(30.30±14.30)、(75.30±4.96)、(19.36±1.78)、(42.45±17.57)μg·mL-1。皂角刺總黃酮粗提物(含量58.84％)對K562、HCT116、SMMC-7721、Bel-7402的IC50分別為(106.04±35.59)、(106.85±35.77)、(

6、120.68±16.22)、(68.89±2.30)μg·mL-1,P<0.05,皂角刺總黃酮粗提物及純化后的抗腫瘤活性差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)論:采用加熱回流提取-聚酰胺純化的工藝路線,能夠使粗制皂角刺總黃酮產(chǎn)品的純度從58.84％提高到81.84％,利用紫外-可見分光光度法(比色法)測定皂角刺總黃酮含量,方法簡單,且穩(wěn)定性、精密度均良好。皂角刺總黃酮純化后的抗腫瘤活性優(yōu)于粗提物,并且呈現(xiàn)出一定的濃度依賴性,具有較強的體外