CXCR3-CXCL9在胰腺炎中的作用和機制研究.pdf

1、目的:
　　趨化因子(Chemotactic cytokine,Chemokine)是一類小分子細胞因子家族蛋白,通過結(jié)合相應(yīng)的趨化因子受體起作用。研究表明除了趨化免疫細胞外,趨化因子還參與與炎癥、腫瘤、血管新生、移植排斥反應(yīng)和自身免疫反應(yīng)等多種病理生理過程。其中多種趨化因子及趨化因子受體與急慢性胰腺炎的發(fā)病和發(fā)展有關(guān)。目前認為CXCR3受體及其配體在多種臟器的急慢性損傷均發(fā)揮重要作用,如:急性肺損傷、肺纖維化、慢性肝炎、肝纖維化

2、和腎纖維化等,但是其在胰腺炎中的作用尚未見報道。本研究旨在研究CXCR-3受體及其配體在胰腺炎中的表達;并在CXCR3受體基因敲除和制備重組CXCL9蛋白的基礎(chǔ)上,探討CXCR3/CXCL9在胰腺炎中的作用。
　　方法:
　　1.建立左旋精氨酸誘導(dǎo)的胰腺急性損傷模型,通過基因芯片篩查胰腺損傷和修復(fù)相關(guān)的趨化因子基因的動態(tài)變化。檢測CXCR3受體配體在左旋精氨酸誘導(dǎo)急性胰腺炎中的表達變化。
　　2.在建立左旋精氨酸誘導(dǎo)急

3、性壞死性胰腺炎模型和雨蛙肽誘導(dǎo)急性水腫性胰腺炎模型基礎(chǔ)上,研究CXCR3受體對急性胰腺炎的作用。在急性水腫性胰腺炎中,小鼠分為野生型小鼠組和CXCR3-/-組,予以50mg/kg雨蛙肽腹腔注射10次,間隔1h,于6h和12h時處死小鼠,收集血清、胰腺和肺組織。檢測血清淀粉酶和脂肪酶,胰腺和肺組織切片觀察胰腺損傷和胰腺炎相關(guān)肺損傷,酶組織化學(xué)法檢測組織中髓過氧化物酶(MPO)活性變化。在急性壞死性胰腺炎中,小鼠分為野生型小鼠組和CXCR3

4、-/-組,予以4g/kg左旋精氨酸腹腔注射2次,間隔1h,于2d、3d和4d時處死小鼠,收集血清、胰腺和肺組織。檢測血清淀粉酶和脂肪酶,胰腺和肺組織切片觀察胰腺損傷和胰腺炎相關(guān)肺損傷,酶組織化學(xué)法檢測組織中髓過氧化物酶(MPO)活性變化。為了進一步檢測CXCR3受體對左旋精氨酸誘導(dǎo)胰腺急性損傷后修復(fù)的影響,小鼠同樣分為野生型小鼠組和CXCR3-/-組,予以4g/kg左旋精氨酸腹腔注射2次,間隔1h,于5d、7d、10d和14d時處死小鼠

5、,收集胰腺組織,切片Masson染色和VG染色,觀察胰腺組織實質(zhì)修復(fù)和間質(zhì)膠原沉積。
　　3.在建立雨蛙肽誘導(dǎo)慢性胰腺炎模型和胰管結(jié)扎誘導(dǎo)慢性胰腺炎模型基礎(chǔ)上,免疫組化、Western-blot和RT-PCR檢測CXCR3受體及其配體的表達。在雨蛙肽誘導(dǎo)慢性胰腺炎中,小鼠分為野生型小鼠組和CXCR3-/-組,予以50mg/kg雨蛙肽腹腔注射10次,間隔1h,每周3回,連續(xù)4w,在2w和4w收集血清、胰腺組織,胰腺組織HE染色和Ma

6、sson染色觀察組織病理學(xué)變化,酶組織化學(xué)法檢測組織羥脯氨酸含量。檢測血清中淀粉酶和脂肪酶,ELISA法檢測血清中Timp-1、IGF-1、IFN-γ和IL-6的含量。PCNA、a-amylase、TUNEL染色檢測胰腺細胞增殖和凋亡。在胰管結(jié)扎誘導(dǎo)慢性胰腺炎中,小鼠分為野生型小鼠組和CXCR3-/-組,行胰管結(jié)扎,在5d、10d和14d收集血清、胰腺組織,胰腺組織HE染色和Masson染色觀察組織病理學(xué)變化,酶組織化學(xué)法檢測組織羥脯氨

7、酸含量。檢測血清中淀粉酶和脂肪酶,ELISA法檢測血清中IFN-γ和IL-6的含量。
　　4.在建立?；悄懰徕c誘導(dǎo)大鼠急性胰腺炎模型和三硝基苯磺酸誘導(dǎo)慢性胰腺炎模型基礎(chǔ)上,免疫組化、Western-blot和ELISA檢測CXCL9的表達,并研究重組CXCL9(rCXCL9)對胰腺炎的作用。在牛磺膽酸鈉誘導(dǎo)大鼠急性胰腺炎中,大鼠分為假手術(shù)對照組、NS組、rCXCL9組和抗體組,逆行胰膽管灌注3.5％的牛磺膽酸鈉溶液,在5d收集血清

8、和胰腺組織。胰腺組織HE染色和Masson染色觀察組織病理學(xué)變化,酶組織化學(xué)法檢測組織羥脯氨酸含量,檢測血清中淀粉酶、脂肪酶和乳酸脫氫酶。在三硝基苯磺酸誘導(dǎo)慢性胰腺炎中,大鼠分為假手術(shù)對照組、NS組、rCXCL9組和抗體組,逆行胰膽管灌注3.5％的?；悄懰徕c溶液,在4w收集血清和胰腺組織。胰腺組織HE染色和Masson染色觀察組織病理學(xué)變化,酶組織化學(xué)法檢測組織羥脯氨酸含量,檢測血清中淀粉酶、脂肪酶和乳酸脫氫酶。同時,Von Frey

9、Filamem法檢測rCXCL9對慢性胰腺炎疼痛的作用。
　　5.組織植塊法分離并培養(yǎng)大鼠和小鼠胰腺星狀細胞。細胞免疫熒光檢測a-SMA、Desmin、GFAP和Fibronectin的表達。將大鼠胰腺星狀細胞分別接種到培養(yǎng)板中,分別加入0、20、200和2000ng/ml的CXCL9,蛋白孵育2d。檢測大鼠胰腺星狀細胞中的Collagen1a1、TGF-β1、CXCR3蛋白的表達。將從野生型和CXCR3-/-小鼠分離的胰腺星狀細

10、胞分別加入0和10μg/ml的CXCL9,蛋白孵育2d,檢測小鼠胰腺星狀細胞中的Collagen1a1、TGF-β1、TIMP-1、MMP-1、MMP-9和CXCR3蛋白的表達。
　　結(jié)果:
　　1.左旋精氨酸誘導(dǎo)的急性胰腺胰腺損傷表現(xiàn)為腺泡細胞壞死、炎性細胞浸潤,在修復(fù)過程中可以觀察到導(dǎo)管復(fù)合體和間質(zhì)膠原沉積的形成?；蛐酒瑱z測的結(jié)果顯示CXCL9mRNA在左旋精氨酸誘導(dǎo)的胰腺炎中表達上升顯著。而RT-PCR驗證則顯示CX

11、CL9-11和CXCL4的mRNA均存在表達上升,提示CXCR3可能參與左旋精氨酸誘導(dǎo)的急性胰腺胰腺損傷。
　　2.CXCR3受體基因敲除對雨蛙肽誘導(dǎo)的急性水腫性胰腺炎和左旋精氨酸誘導(dǎo)的急性壞死性胰腺炎的急性期損傷均無明顯作用。表現(xiàn)為:野生型組和CXCR3-/-組之間,血清淀粉酶和脂肪酶、胰腺水腫和MPO含量均無顯著差異,組織切片觀察亦有類似結(jié)果。但是CXCR3基因敲除后,胰腺炎相關(guān)肺損傷明顯好轉(zhuǎn)。表現(xiàn)在:與野生型組相比,CXCR

12、3-/-組的肺組織水腫和炎癥細胞浸潤明顯緩解,肺組織內(nèi)MPO含量顯著下降。同時,CXCR3受體基因敲除對左旋精氨酸誘導(dǎo)的胰腺急性損傷后的修復(fù)過程有影響,主要表現(xiàn)在腺泡細胞修復(fù)受阻和間質(zhì)膠原沉積增加。
　　3.CXCR3受體及其配體雨蛙肽和胰管結(jié)扎誘導(dǎo)的慢性胰腺炎中均存在表達上調(diào),同時CXCR3受體基因敲除可以加重雨蛙肽和胰管結(jié)扎誘導(dǎo)的纖維化。組織切片觀察顯示:與野生型組相比,CXCR3-/-組的胰腺慢性損傷并未有明顯改變,但是間質(zhì)

13、纖維化百分比顯著升高。CXCR3-/-組的胰腺組織羥脯氨酸含量亦明顯升高。在雨蛙肽誘導(dǎo)的慢性胰腺炎中,CXCR3受體基因敲除對腺泡細胞的增殖和凋亡沒有明顯影響,但是可以降低血清中IFN-γ的含量,而升高IL-6的含量。
　　4.CXCL9在?；悄懰徕c誘導(dǎo)大鼠急性胰腺炎和三硝基苯磺酸誘導(dǎo)慢性胰腺炎中均存在明顯的表達上調(diào)。在使用重組CXCL9后,兩者的組織間質(zhì)膠原沉積均明顯好轉(zhuǎn),表現(xiàn)為:胰腺組織內(nèi)的纖維化百分比和羥脯氨酸含量下降;而使

14、用抗CXCL9抗體血清后,兩者的組織間質(zhì)膠原沉積明顯加重。使用重組CXCL9可以緩解牛磺膽酸鈉導(dǎo)致的胰腺實質(zhì)組織的損傷,但是對三硝基苯磺酸導(dǎo)致的胰腺實質(zhì)損傷影響不大,不過可以緩解三硝基苯磺酸引起的胰腺疼痛。
　　5.活化的胰腺星狀細胞可以表達CXCR3受體,在使用重組CXCL9共同孵育后,大鼠星狀細胞合成Collagen1a1和TGF-β1減少,但是對CXCR3的合成沒有明顯影響。重組CXCL9共同孵育后,小鼠星狀細胞合成Coll

15、agen1a1、TGF-β1和TIMlP-1減少,合成MMP-2增加;但是CXCR3-/-基因敲除后,重組CXCL9不能引起這些蛋白合成的改變。
　　結(jié)論:
　　1.CXCR3受體基因敲除對急性胰腺炎時的急性胰腺損傷影響不大,但是可以緩解急性解胰腺炎相關(guān)的肺損傷。
　　2.CXCR3受體參與急性胰腺炎損傷后的組織修復(fù),CXCR3受體基因敲除后,胰腺損傷后的組織修復(fù)受損。
　　3.CXCR3參與慢性胰腺炎的發(fā)病,并