產(chǎn)黃頭孢霉cefG基因的克隆、表達(dá)與抗體制備的研究.pdf

1、β-內(nèi)酰胺類抗生素，通過(guò)干擾細(xì)菌細(xì)胞壁的合成并破壞已有細(xì)胞壁而起到殺菌的作用。目前，β-內(nèi)酰胺類抗生素的全球銷量已達(dá)到150億美元，占著半合成抗生素市場(chǎng)的65％。這其中又以青霉素類(Penicillins)和頭孢菌素類藥物(Cephalosporins)為主導(dǎo)產(chǎn)品。頭孢菌素類藥物以其低毒、耐酸、可修飾位點(diǎn)多[1]等優(yōu)勢(shì)正日益成為抗生素市場(chǎng)的主流。目前頭孢菌素類藥物的銷售額占到整個(gè)抗生素市場(chǎng)的4成，美國(guó)達(dá)到45％，而日本甚至達(dá)到49.34

2、％。
　　 頭孢菌素類抗生素多是以頭孢菌素C(CPC)為原料得到7-氨基頭孢烷酸，在此基礎(chǔ)上再經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾，得到各種半合成頭孢菌素藥物。CPC是頂頭孢霉屬的代謝產(chǎn)物，在它的生物合成中，最后一步反應(yīng)是由脫乙酰頭孢菌素C(DAC)經(jīng)乙酰轉(zhuǎn)移酶催化變成CPC[2]，這個(gè)過(guò)程被證實(shí)是CPC生物合成的限速步驟[3]，其原因是乙酰轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)量太低。目前國(guó)內(nèi)針對(duì)乙酰轉(zhuǎn)移酶及其編碼基因——cefG的研究并沒(méi)有太多報(bào)道。
　　 根據(jù)NC

3、BI上的查詢結(jié)果，產(chǎn)黃頭孢霉的cefG基因是一條含兩個(gè)內(nèi)含子的基因序列，無(wú)法從基因組直接擴(kuò)增。本文采用體外合成的方法可以得到去掉內(nèi)含子的cefG基因。以NCBI報(bào)道的來(lái)源于菌株AJ404737的cefG序列作為模板，去掉內(nèi)含子，設(shè)計(jì)38條首尾互補(bǔ)的引物，通過(guò)Assembly PCR拼接成一條完整的DNA片段，經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)有3個(gè)位點(diǎn)發(fā)生堿基缺失。通過(guò)定點(diǎn)突變的方法對(duì)缺失部分逐一修改，并通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性PCR檢驗(yàn)突變是否成功。每突變一個(gè)位點(diǎn)都經(jīng)過(guò)引

4、物設(shè)計(jì)、PCR擴(kuò)增、DpnⅠ消化、轉(zhuǎn)化、驗(yàn)證和測(cè)序幾個(gè)步驟，最終得到與NCBI上所登錄的完全匹配的cefG基因。
　　 為了得到較高產(chǎn)量和純度的乙酰轉(zhuǎn)移酶蛋白，用于抗體制備、免疫印跡檢測(cè)，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了pET30-cefG表達(dá)質(zhì)粒，37℃下誘導(dǎo)表達(dá)出大量重組蛋白，且都是不溶的包涵體。將重組菌超聲破碎后，不溶部分用不同濃度尿素做梯度洗脫，最后用8M尿素溶解沉淀，所得乙酰轉(zhuǎn)移酶包涵體純度達(dá)到96％以上，達(dá)到抗體制備或免疫印記實(shí)驗(yàn)要求。

5、
　　 將純化后的包涵體免疫6周齡的BALB/C雌鼠，約1個(gè)半月后取尾血得到抗血清。通過(guò)抗原包被的酶聯(lián)免疫分析技術(shù)(ELISA)檢測(cè)，所得抗體效價(jià)達(dá)到8000以上，完全滿足實(shí)驗(yàn)需要。利用所得抗體，本文先繪制出乙酰轉(zhuǎn)移酶標(biāo)準(zhǔn)曲線以確定抗原最適檢測(cè)濃度，然后在大腸桿菌中檢測(cè)了乙酰轉(zhuǎn)移酶與菌體生長(zhǎng)的關(guān)系，證明所制備抗體能夠用于體外檢測(cè)乙酰轉(zhuǎn)移酶。
　　 為了使克隆的cefG基因能與產(chǎn)黃頭孢霉基因組進(jìn)行重組并順利表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)利用

6、威斯康辛大學(xué)D.cullen教授饋贈(zèng)的質(zhì)粒pDH25構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pDH25-cefG。同時(shí)制備產(chǎn)黃頭孢霉原生質(zhì)體，研究了原生質(zhì)體對(duì)潮霉素B的耐受性，確定其最低耐受濃度為6μg·mL-1。最后嘗試在不同電壓下用電轉(zhuǎn)化方法將重組質(zhì)粒導(dǎo)入產(chǎn)黃頭孢霉原生質(zhì)體。
　　 本研究探討了采用ELISA法，快速、高效、精確地檢測(cè)乙酰轉(zhuǎn)移酶含量，在頭孢菌素生產(chǎn)菌的基因工程改造工作中取得了階段性成果，為進(jìn)一步研究cefG基因在頭孢菌素生產(chǎn)菌中的