不同反應(yīng)體系中黑根霉催化甾體C11α-羥基化的研究.pdf

1、本論文研究了黑根霉(Rhizopus nigricans)生物催化甾體的C11α羥基化反應(yīng)。考察了水相發(fā)酵體系下轉(zhuǎn)化條件對(duì)黑根霉轉(zhuǎn)化效果的影響，重點(diǎn)構(gòu)建了一個(gè)適合黑根霉生物催化甾體C11α-羥基化的兩相體系以及研究了固定化技術(shù)在兩相發(fā)酵體系中的應(yīng)用。對(duì)比了黑根霉對(duì)三種甾體底物轉(zhuǎn)化能力的差異。
　　 首先，研究了水相培養(yǎng)條件對(duì)黑根霉菌體生長(zhǎng)狀態(tài)的影響，同時(shí)對(duì)比了不同菌體形態(tài)對(duì)轉(zhuǎn)化效率的差別，發(fā)現(xiàn)帶有絨毛狀菌絲的菌球轉(zhuǎn)化效果最好。成

2、球條件為孢子接種濃度為107個(gè)孢子/mL，發(fā)酵溫度28℃，轉(zhuǎn)速為150 r/min。從發(fā)酵過(guò)程曲線和轉(zhuǎn)化過(guò)程來(lái)看，前8h為延滯期，9～22h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在第22h發(fā)酵液pH降到了3.8，溶氧降到10％，菌體培養(yǎng)成熟，此時(shí)為投入底物的最佳時(shí)期，轉(zhuǎn)化的第44h為轉(zhuǎn)化終止時(shí)間。而250mL三角瓶裝液量為50mL，投料濃度為2％，轉(zhuǎn)化pH4.6為最佳的轉(zhuǎn)化條件。水相發(fā)酵體系下的羥化酶誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)確定了0.2％的底物誘導(dǎo)濃度，誘導(dǎo)菌齡為16h，誘導(dǎo)

3、時(shí)長(zhǎng)為8h。從助溶劑和表面活性劑角度看，吐溫-80的效果最好，底物經(jīng)吐溫-80處理后最終轉(zhuǎn)化率比對(duì)照提高了18％，甲醇的效果比乙醇好，甲醇的最佳添加量為4％。
　　 其次，重點(diǎn)研究了兩相轉(zhuǎn)化體系的建立。從有機(jī)溶劑的對(duì)甾體的溶解度、對(duì)黑根霉細(xì)胞的毒性和最終的轉(zhuǎn)化效果來(lái)看，乙酸丁酯足作為有機(jī)相的最佳選擇。優(yōu)化了此體系的最佳轉(zhuǎn)化條件，乙酸丁酯相與發(fā)酵液相的體積比為1:5，最適轉(zhuǎn)化溫度為25℃。而從不同的水相對(duì)比來(lái)看，發(fā)酵液比緩沖液和無(wú)

4、菌水的效果都好。之后考察了氧促進(jìn)劑H2O2和外電子受體維生素K3對(duì)C11α-羥基化轉(zhuǎn)化率的影響方面，前者的最佳添加量為1％，比對(duì)照體系轉(zhuǎn)化率提高了8％；后者的最佳添加量為0.1％，比對(duì)照體系轉(zhuǎn)化率提高了6％。從底物的角度看，黑根霉催化16α，17α-環(huán)氧黃體酮11α羥基化的效率最高。
　　 最后，研究了固定化細(xì)胞在兩相體系中的應(yīng)用。從選擇的3種固定化方法來(lái)看，海藻酸鈣包埋法的效果最好。雖然轉(zhuǎn)化率并沒(méi)有比游離體系有所提高，但是酶活