Tn5轉(zhuǎn)座系統(tǒng)在運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌中的應(yīng)用.pdf

1、充分利用木質(zhì)纖維素水解液中的所有糖源，是以木質(zhì)纖維素為原料發(fā)酵燃料乙醇的一個(gè)關(guān)鍵因素。木糖是木質(zhì)纖維素中最重要的五碳糖組分，也是自然界僅次于葡萄糖的第二大糖源，因此人們?cè)陂_(kāi)發(fā)能同時(shí)發(fā)酵葡萄糖和木糖生成乙醇的微生物菌種上做了很多工作。運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌作為一種乙醇生產(chǎn)菌，可以通過(guò)ED途徑專(zhuān)一代謝葡萄糖、果糖、蔗糖作為碳源和能源，同時(shí)具有高乙醇得率，高乙醇耐受性等優(yōu)點(diǎn)，但是Z.mobilis的缺點(diǎn)是底物利用范圍較窄，僅限于葡萄糖、果糖和蔗糖，而

2、不能利用木糖。 在實(shí)驗(yàn)室的前期工作中分別克隆了構(gòu)建木糖代謝路徑需要的四個(gè)酶的基因，即xylA，xylB，talB和tktA基因，并將其整合至穿梭載體后轉(zhuǎn)化至Z.mobilisZM4中。本工作的目的就是利用Tn5轉(zhuǎn)座系統(tǒng)將木糖利用的相關(guān)基因整合至染色體上。為了利用抗性更加有效的篩選到轉(zhuǎn)化子，同時(shí)還整合了氯霉素抗性基因作為篩選標(biāo)記。 首先構(gòu)建了兩個(gè)中轉(zhuǎn)質(zhì)粒pUC18NotI-Cm-XX和pUC18SfiI-TT，即將外源基因

3、首先整合到輔助質(zhì)粒pUC18NotI與pUC18SfiI中，而后再利用Sfil，Notl兩個(gè)稀有酶切位點(diǎn)將外源基因整合至系統(tǒng)質(zhì)粒pUT中，而后通過(guò)接合轉(zhuǎn)移的方法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入Z.mobilis ZM4中。由于pUT質(zhì)粒上含有可以編碼轉(zhuǎn)座酶的tnp基因，在轉(zhuǎn)座酶的作用下，得到了外源基因轉(zhuǎn)座至Z.mobilis ZM4染色體中的轉(zhuǎn)化子。 對(duì)檢出的轉(zhuǎn)化子提取染色體基因組，經(jīng)PCR驗(yàn)證證明外源基因確實(shí)整合到了Z.mobilis ZM4