短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)Tn5轉(zhuǎn)座突變體系的構(gòu)建及抑菌篩選分析.pdf

1、以水稻葉面附生菌B. pumilus DX01菌株為研究對(duì)象，通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化法將Tn5轉(zhuǎn)座子插入到芽孢桿菌的基因組中，在優(yōu)化電擊轉(zhuǎn)化體系的基礎(chǔ)上構(gòu)建了系列T-DNA插入突變株，并對(duì)突變株進(jìn)行了抑菌篩選分析，具體結(jié)果如下：
　　1.構(gòu)建了Tn5轉(zhuǎn)座載體pMOD-trpChph，建立和優(yōu)化了短小芽孢桿菌Tn5轉(zhuǎn)座子電擊轉(zhuǎn)化技術(shù)體系，得到了2633個(gè)突變子。通過(guò)考察感受態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)濃度、電擊電壓、電擊緩沖液及復(fù)蘇培養(yǎng)基的選擇四個(gè)因素對(duì)Tn5

2、轉(zhuǎn)座載體的電轉(zhuǎn)化效果的影響，確定了實(shí)驗(yàn)室條件下的適宜轉(zhuǎn)化體系，即當(dāng)細(xì)菌培養(yǎng)至OD600為0.96時(shí)，采用AEB電轉(zhuǎn)緩沖液處理，并在2.4 kV/cm電壓下電擊轉(zhuǎn)化能獲得較高的轉(zhuǎn)化率。隨機(jī)抽取20個(gè)繼代培養(yǎng)15代后，結(jié)果顯示突變株遺傳穩(wěn)定，沒(méi)有T-DNA丟失現(xiàn)象。對(duì)突變株的PCR分析及Southern blot驗(yàn)證結(jié)果表明Tn5轉(zhuǎn)座元件已隨機(jī)插入到DX01基因組中，突變株單拷貝率為50％。
　　2.通過(guò)突變株與稻瘟病菌的平板對(duì)峙初篩

3、及水稻活體防效試驗(yàn)復(fù)篩，共篩選出2株對(duì)稻瘟病菌拮抗活性顯著增強(qiáng)（Tn5-901、Tn5-1960）及4株拮抗活性顯著減弱的突變株（Tn5-21、Tn5-194、Tn5-975、Tn5-1652）。分別測(cè)定其幾丁質(zhì)酶活性和蛋白酶活性，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明此6株突變株在平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)中與對(duì)照DX01相比均達(dá)到極顯著水平（p<0.01），在酶活測(cè)定實(shí)驗(yàn)中達(dá)到顯著水平（p<0.05）。幾丁質(zhì)酶活相比蛋白酶活更能印證平板對(duì)峙試驗(yàn)結(jié)果，它可以作為快速篩選

4、拮抗性突變株的重要酶指標(biāo)。其中，突變株 Tn5-194對(duì)稻瘟病菌的抑菌活性為極顯著減弱，而突變株Tn5-901則極顯著上升，這2株突變株可以作為短小芽孢桿菌抑菌活性相關(guān)基因的克隆及比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究的理想實(shí)驗(yàn)材料。
　　3.對(duì)6株目標(biāo)突變株進(jìn)行了細(xì)菌生長(zhǎng)速度的測(cè)定和發(fā)酵液抑制稻瘟病菌孢子萌發(fā)的試驗(yàn)，結(jié)果顯示相對(duì)于野生型菌株 DX01來(lái)說(shuō)，突變株Tn5-194、Tn5-975及Tn5-1652的生長(zhǎng)速率明顯變慢，且Tn5-194和T

5、n5-1652提早進(jìn)入衰亡期。發(fā)酵液處理稻瘟病菌孢子8 h后，發(fā)現(xiàn)病原菌孢子在未添加拮抗菌的LB中萌發(fā)率達(dá)到99%，經(jīng)DX01處理后孢子萌發(fā)率為64%，突變株Tn5-21、Tn5-194、Tn5-975、Tn5-1652處理的孢子萌發(fā)率都達(dá)到97%以上，Tn5-1960處理的萌發(fā)率為73%，而Tn5-901處理的孢子萌發(fā)率僅為4%。
　　4.突變株Tn5-194對(duì)稻瘟病菌的抗性較DX01菌株為極顯著減弱, PCR和Southern