短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)Tn5轉座突變體系的構建及抑菌篩選分析.pdf

1、以水稻葉面附生菌B. pumilus DX01菌株為研究對象，通過電擊轉化法將Tn5轉座子插入到芽孢桿菌的基因組中，在優(yōu)化電擊轉化體系的基礎上構建了系列T-DNA插入突變株，并對突變株進行了抑菌篩選分析，具體結果如下：
　　1.構建了Tn5轉座載體pMOD-trpChph，建立和優(yōu)化了短小芽孢桿菌Tn5轉座子電擊轉化技術體系，得到了2633個突變子。通過考察感受態(tài)細胞培養(yǎng)濃度、電擊電壓、電擊緩沖液及復蘇培養(yǎng)基的選擇四個因素對Tn5

2、轉座載體的電轉化效果的影響，確定了實驗室條件下的適宜轉化體系，即當細菌培養(yǎng)至OD600為0.96時，采用AEB電轉緩沖液處理，并在2.4 kV/cm電壓下電擊轉化能獲得較高的轉化率。隨機抽取20個繼代培養(yǎng)15代后，結果顯示突變株遺傳穩(wěn)定，沒有T-DNA丟失現(xiàn)象。對突變株的PCR分析及Southern blot驗證結果表明Tn5轉座元件已隨機插入到DX01基因組中，突變株單拷貝率為50％。
　　2.通過突變株與稻瘟病菌的平板對峙初篩

3、及水稻活體防效試驗復篩，共篩選出2株對稻瘟病菌拮抗活性顯著增強（Tn5-901、Tn5-1960）及4株拮抗活性顯著減弱的突變株（Tn5-21、Tn5-194、Tn5-975、Tn5-1652）。分別測定其幾丁質酶活性和蛋白酶活性，經(jīng)統(tǒng)計學分析表明此6株突變株在平板對峙實驗中與對照DX01相比均達到極顯著水平（p<0.01），在酶活測定實驗中達到顯著水平（p<0.05）。幾丁質酶活相比蛋白酶活更能印證平板對峙試驗結果，它可以作為快速篩選

4、拮抗性突變株的重要酶指標。其中，突變株 Tn5-194對稻瘟病菌的抑菌活性為極顯著減弱，而突變株Tn5-901則極顯著上升，這2株突變株可以作為短小芽孢桿菌抑菌活性相關基因的克隆及比較蛋白質組學研究的理想實驗材料。
　　3.對6株目標突變株進行了細菌生長速度的測定和發(fā)酵液抑制稻瘟病菌孢子萌發(fā)的試驗，結果顯示相對于野生型菌株 DX01來說，突變株Tn5-194、Tn5-975及Tn5-1652的生長速率明顯變慢，且Tn5-194和T

5、n5-1652提早進入衰亡期。發(fā)酵液處理稻瘟病菌孢子8 h后，發(fā)現(xiàn)病原菌孢子在未添加拮抗菌的LB中萌發(fā)率達到99%，經(jīng)DX01處理后孢子萌發(fā)率為64%，突變株Tn5-21、Tn5-194、Tn5-975、Tn5-1652處理的孢子萌發(fā)率都達到97%以上，Tn5-1960處理的萌發(fā)率為73%，而Tn5-901處理的孢子萌發(fā)率僅為4%。
　　4.突變株Tn5-194對稻瘟病菌的抗性較DX01菌株為極顯著減弱, PCR和Southern