TNF-α對急性肝衰竭大鼠發(fā)生腸道細菌移位時腸粘膜Claudin-1、ZO-1和MLCK表達的影響及TNF-α拮抗劑的干預效果.pdf

1、目的：
　　研究腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）對急性肝衰竭（Acute liver failure,ALF）大鼠發(fā)生腸道細菌移位時腸粘膜Claudin-1、ZO-1蛋白和肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase,MLCK)表達的影響及TNF-α拮抗劑干預效果。
　　方法：
　　健康雄性SD大鼠54只，按隨機數字表法隨機分成3組，正常對照組6只腹

2、腔注射0.9％生理鹽水12ml/kg；模型組、干預組各24只，均給予腹腔注射D-氨基半乳糖(D-GalN)1200 mg/kg建立急性肝衰竭模型，干預組在給予D-氨基半乳糖24小時前給予腹腔注射TNF-α拮抗劑（rhTNFR:Fc益賽普）12.5mg/kg。模型組與干預組于腹腔注射D-氨基半乳糖后8、24、48、72h各處死6只動物，正常對照組于72h同時處死動物，進行以下指標檢測：①取各組肝、脾和腸系膜淋巴結組織勻漿進行細菌培養(yǎng)；②應

3、用生化學方法檢測血清ALT、AST、Tbil、Alb水平；③酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)方法檢測血清TNF-α的水平；④肝組織和末段回腸組織經HE染色后光鏡下觀察病理變化；⑤免疫組化和Western blot檢測各組末段回腸Claudin-1、ZO-1蛋白和MLCK的表達。
　　結果：
　　1、模型組與干預組ALT、AST逐漸升高，均于48h達到高峰，但干預組高峰較模型組高峰明顯降低；隨著時間延長，模型組與干預組出現總膽紅

4、素升高，但模型組的總膽紅素升高速度比干預組明顯快；模型組72h轉氨酶開始出現下降時，總膽紅素繼續(xù)上升，出現膽酶分離現象，而干預組72h總膽紅素出現下降。急性肝衰竭模型組72h肝臟組織呈大片融合壞死，超過整個切片面積的2/3，肝臟組織的正常結構消失，僅殘留少量肝細胞，肝竇出血、充血明顯，在壞死區(qū)及匯管區(qū)可見大量炎性細胞浸潤，符合急性肝衰竭病理改變，急性肝衰竭模型誘導成功；干預組72h肝臟組織可見部分肝細胞水腫、點狀壞死，少量炎性細胞呈散在

5、性浸潤于肝小葉內和匯管區(qū)；在光鏡下模型組72h末段回腸可見絨毛伏倒，部分絨毛尖端脫落，絨毛黏膜和黏膜下層間質水腫，黏膜層可見大量中性粒細胞浸潤。干預組72h末段回腸結完整，未見粘膜上皮細胞脫落壞死情況，絨毛黏膜和黏膜下層間質輕度水腫，黏膜層可見少量中性粒細胞浸潤。
　　2、正常對照組、模型組8h和干預組8h均未出現臟器細菌培養(yǎng)陽性，模型組24h、48h和72h臟器細菌移位率分別為11.1%、38.89%和66.67%，干預組24h

6、、48h和72h臟器細菌移位率分別為5.56%、16.67%和27.78%。對照組與模型組、對照組與干預組24h、48h和72h之間比較差異均具有統(tǒng)計學意義，均P<0.05；干預組和模型組兩組24h、48h和72h之間的比較差異均具有統(tǒng)計學意義，均P<0.05。
　　3、模型組大鼠8h的TNF-α含量為（117.89±13.09pg/ml），24h上升至高峰（239.83±15.81pg/ml），隨后開始下降，48h、72h分別降

7、低至（149.37±20.86pg/ml、96.41±4.21pg/ml），與正常對照組（24.19±3.57pg/ml）比較差異均有顯著性差異（P<0.01）；而干預組大鼠的血清TNF-α含量于8h（52.06±18.06pg/ml）逐漸升高，于24h達到高峰（182.71±17.08pg/ml），48h開始下降至（71.78±20.15pg/ml），72h進一步下降為（57.22±7.39pg/ml），與正常對照組比較差異均有統(tǒng)計學

8、意義（干預組8h、48h與正常對照組的P<0.05，24h、72h的P<0.01），且與模型組各時間點TNF-α含量比較差異均有顯著性統(tǒng)計學意義（P<0.01）。
　　4、western blot測定相對蛋白含量，模型組8h Claudin-1蛋白水平為0.9932±0.1849，與正常對照組1.640±0.1879的差異有統(tǒng)計學意義（t=4.908，p<0.01），逐漸下降，24h降至最低0.3546±0.068，明顯低于對照組

9、（t=12.87，p<0.01），72h為0.8322±0.1169，低于對照組（t=7.301，p<0.01）；干預組8h Claudin1蛋白為1.387±0.2163，與對照組相比無差異（t=1.770，p>0.05），但與模型組8h比較稍高，差異有統(tǒng)計學（t=2.765，p<0.05）；24h驟降至1.051±0.3702，明顯低于對照組（t=2.838，p<0.05），而高于模型組24h（t=3.700，p<0.05）；72h

10、為1.18103±0.1501，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（t=3.818，p<0.01），高于模型組72h（t=3.668，p<0.05）。模型組8h ZO-1蛋白水平為0.7256±0.09153，與正常對照組的1.015±0.1503差異有統(tǒng)計學意義（t=3.293，p<0.05），逐漸下降，24h降至最低0.3874±0.09148，明顯低于對照組（t=7.137，p<0.01），72h為0.5867±0.1780，明顯低于對

11、照組（t=4.534，p<0.01）；干預組8h ZO-1蛋白為0.8179±0.1190，與對照組相比無差異（t=2.060，p>0.05），與模型組8h比較稍高，差異亦無統(tǒng)計學（t=1.229，p>0.05），24h驟降至0.6423±0.08182，明顯低于對照組（t=4.36，p<0.05），而高于模型組24h，差異有統(tǒng)計學意義（t=4.153，p<0.01），72h為0.7622±0.09943，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（

12、t=2.653，p<0.05），仍高于模型組72h（t=2.824，p<0.05）。模型組8h MLCK蛋白水平為0.6959±0.1295，與正常對照組的0.4597±0.06882差異有統(tǒng)計學意義（t=3.221，p<0.05），逐漸升高，24h升至高峰1.298±0.1935，明顯高于對照組（t=8.164，p<0.01），72h為0.9255±0.1575，高于對照組（t=5.420，p<0.01）；干預組8h MLCK蛋白為0

13、.5716±0.1566，與對照組相比無差異（t=1.308，p>0.05），與模型組8h比較稍低，差異亦無統(tǒng)計學（t=1.224，p>0.05），隨后逐漸升高，24h為1.033±0.07282，明顯高于對照組（t=11.44，p<0.01），但低于模型組24h，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.564，p<0.05），72h恢復至0.6338±0.09899，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（t=2.889，p=0.0277，p<0.05），低

14、于模型組72h，比較有統(tǒng)計學意義（t=3.136，p<0.05）。免疫組化結果顯示正常對照組的Claudin-1和ZO-1蛋白定位在細胞膜頂端，大量棕褐色染色信號陽性，MLCK蛋白在胞漿中可見棕褐色染色信號。模型組72h的Claudin-1和ZO-1蛋白在細胞膜頂端表現為棕褐色信號減弱，呈鋸齒狀分布并有中斷現象，但MLCK蛋白的棕褐色染色信號呈強陽性。Claudin-1蛋白在干預組72h回腸組織內陽性信號稍有減弱，與正常對照組比較陽性染

15、色信號有所下降，但與模型組比較陽性信號明顯增強；ZO-1蛋白在干預組72h回腸組織內可見棕褐色陽性染色信號，與正常對照組比較有所減弱，但與模型組比較有增強變化；MLCK蛋白在干預組72h回腸腸粘膜上皮細胞胞漿中強陽性染色信號，比正常對照組染色信號稍強，但比模型組72h染色信號減弱。
　　結論：
　　急性肝衰竭大鼠模型的血清TNF-α水平升高，TNF-α通過增加MLCK含量使得細胞收縮加劇及細胞間隙增大，同時TNF-α使Cla