miR-497對ST段抬高型心肌梗死患者急診PCI術(shù)后無復(fù)流的影響及機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　無復(fù)流（no-reflow）概念早期臨床應(yīng)用在急性心肌梗死溶栓治療的血流評價(jià)，目前是指在冠狀動(dòng)脈病變行再通治療以后，排除病變部位急性閉塞、高度狹窄、血栓、嚴(yán)重夾層、心外膜血管痙攣等因素后冠脈前向血流急性減少，TIMI血流分級(jí)≤Ⅰ級(jí)者為無復(fù)流，TIMIⅡ級(jí)者為慢血流（slow-flow）。冠脈無復(fù)流目前機(jī)制仍然不明確，目前認(rèn)為與多種因素導(dǎo)致的微血管功能障礙有關(guān)，它使惡性心律失常率、再次心肌梗死率及死亡率增加10倍左右，而

2、且心功能障礙多見，是急性心肌梗死（AMI）遠(yuǎn)期心血管事件的獨(dú)立預(yù)測指標(biāo)。早期診斷和防治冠脈無復(fù)流有重要的臨床價(jià)值，可大大改善AMI患者心功能及遠(yuǎn)期預(yù)后。盡早使梗死相關(guān)血管（IRA）再通，給予冠脈血管重建，恢復(fù)心肌灌注，是AMI患者治療的關(guān)鍵所在。臨床上，ST段抬高型心肌梗死（STEMI）患者起病12小時(shí)內(nèi)首選急診介入治療，經(jīng)治療后雖然可使梗死相關(guān)血管再通，但仍有相當(dāng)一部分病人因發(fā)生無復(fù)流或慢血流而引起冠脈微血管損傷和功能異常，最終導(dǎo)致預(yù)

3、后不良。因此，心肌微循環(huán)的充分再灌注是血管重建后改善預(yù)后的關(guān)鍵。而STEMI患者PCI術(shù)后的微循環(huán)灌注評估以及預(yù)后的相關(guān)危險(xiǎn)因素目前仍然不明確，需要進(jìn)一步探討研究。
　　MicroRNAs（miRNAs）在真核生物的基因調(diào)控中起著重要作用，廣泛參與了細(xì)胞增殖、分化、發(fā)育、凋亡等多種生理病理活動(dòng)。新近研究發(fā)現(xiàn)：miRNAs在組織或血清中的異常表達(dá)與多種人類疾病密切相關(guān)，對其診斷及預(yù)后分析起著重要的作用。血液中miRNAs能夠在細(xì)胞之

4、外游離存在，并在循環(huán)血液中保持穩(wěn)定，它們有望成為血液中新興的分子標(biāo)志物，對提高疾病診斷和預(yù)后判斷的能力起著巨大的促進(jìn)作用。在疾病的發(fā)生過程中，與組織細(xì)胞中一樣，血液中miRNAs的表達(dá)譜也會(huì)產(chǎn)生特征性的變化，這些特定的 miRNAs表達(dá)譜可構(gòu)成疾病的“指紋”以用于疾病的預(yù)測、診斷和預(yù)后判斷，從而成為一種新的無創(chuàng)傷性診斷標(biāo)志物。目前，血清miRNAs作為心血管疾病生物標(biāo)志物的研究取得了一定的成績。
　　研究發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注的小鼠腦組

5、織 miR-497表達(dá)水平明顯升高；缺氧復(fù)氧損傷的神經(jīng)細(xì)胞 miR-497表達(dá)水平同樣增加，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)相關(guān)的細(xì)胞凋亡信號(hào)通路有關(guān)，提示了 miR-497可以調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。大量研究表明缺血再灌注損傷是冠脈無復(fù)流發(fā)生的主要機(jī)制之一，目前miR-497對急性心肌梗死PCI術(shù)后無復(fù)流的影響并沒有相關(guān)的研究。在心肌缺血再灌注時(shí) miR-497的表達(dá)水平是否同樣升高？急診PCI術(shù)后miR-497的表達(dá)水平是否會(huì)發(fā)生變化？它和無復(fù)流是否相關(guān)？它

6、是否可以通過調(diào)控線粒體凋亡途徑和線粒體的損傷促進(jìn)心肌細(xì)胞的凋亡，從而參與缺血再灌注損傷及無復(fù)流，值得進(jìn)一步研究。
　　本研究的意義在于通過明確血清miR-497表達(dá)水平與STEMI患者急診PCI術(shù)后無復(fù)流的關(guān)系及相關(guān)機(jī)制，為今后將miR-497作為早期診斷無復(fù)流、評估STEMI患者PCI術(shù)后的微循環(huán)灌注和預(yù)后指標(biāo)提供理論依據(jù)；也有利于提高我們對PCI術(shù)后無復(fù)流現(xiàn)象的病理生理機(jī)制的認(rèn)識(shí)；為今后將 miR-497作為冠脈無復(fù)流的治療靶

7、點(diǎn)提供理論依據(jù)。
　　研究目的：
　　本研究擬探討血清miR-497水平與STEMI患者急診PCI術(shù)后無復(fù)流的相關(guān)性以及血清miR-497水平與STEMI患者急診PCI術(shù)后心血管事件發(fā)生的關(guān)系，并在缺氧/復(fù)氧(A/R)損傷的心肌細(xì)胞模型通過采用激動(dòng)劑和拮抗劑研究 miR-497對線粒體凋亡途徑和細(xì)胞凋亡的影響。
　　研究方法：
　　（1）為研究miR-497表達(dá)水平與STEMI患者急診PCI術(shù)后無復(fù)流的關(guān)系，收集

8、患者不同時(shí)刻的（術(shù)前、PCI術(shù)后6h、24h、36h和48h）血清樣本，提取miR-497，觀察miR-497表達(dá)水平。
　?。?）把STEMI患者分成無復(fù)流組和復(fù)流組，觀察miR-497表達(dá)水平與PCI術(shù)后無復(fù)流現(xiàn)象的相關(guān)性，隨訪患者主要不良心臟事件（MACE）發(fā)生率。
　?。?）為研究miR-497的基因調(diào)控功能，構(gòu)建其激動(dòng)劑agomir和拮抗劑antagomir轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞使其過表達(dá)或低表達(dá)miR-497，研究miR-

9、497表達(dá)變化對A/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的影響。
　　（4）為研究miR-497調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞凋亡的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，使用激動(dòng)劑agomir和拮抗劑 antagomir轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞，而后對其進(jìn)行 A/R處理，測定線粒體膜電位、Caspase-3活性，以及Bcl-2、Bax、cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)量。
　　結(jié)果：
　?。?）與對照組相比，STEMI組miR-497表達(dá)水平增加，且隨著時(shí)間的變化（術(shù)前、P

10、CI術(shù)后6h、24h、36h和48h），miR-497表達(dá)水平逐漸降低：miR-497（0.25±0.10 vs4.11±0.54 vs3.36±0.32 vs2.98±0.22 vs1.65±0.11 vs1.01±0.12，P=0.012），提示STEMI患者體內(nèi)miR-497水平明顯升高，隨著心肌缺血缺氧的改善，miR-497水平逐漸降低。
　?。?）急診PCI術(shù)后出現(xiàn)無復(fù)流現(xiàn)象患者在不同時(shí)段miR-497相對表達(dá)量高于復(fù)流

11、患者：術(shù)前（5.36±0.25 vs3.88±0.45，P<0.001），術(shù)后6h（4.10±0.15 vs3.12±0.21，P=0.048），術(shù)后24h(3.88±0.16 vs2.46±0.25，P=0.004)，術(shù)后36h（1.90±0.12 vs1.24±0.18，P=0.022），術(shù)后48h（1.84±0.16 vs0.80±0.12，P<0.001）；多因素logistic回歸分析提示 miR-497高表達(dá)是無復(fù)流發(fā)生的危

12、險(xiǎn)因子(OR=2.733)；隨訪患者主要不良心臟事件（MACE）發(fā)生率，高表達(dá)miR-497組MACE發(fā)生率明顯高于低表達(dá)miR-497組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；主要不良心臟事件的Cox風(fēng)險(xiǎn)比例回歸模型分析結(jié)果也表明miR-497高表達(dá)是MACE獨(dú)立預(yù)測性較強(qiáng)的因子(OR=1.872)。
　　（3）構(gòu)建miR-497激動(dòng)劑agomir和拮抗劑antagomir轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞可以過表達(dá)或低表達(dá)miR-497，過表達(dá)可使心肌細(xì)胞

13、 miR-497表達(dá)上調(diào)大于3.5倍，低表達(dá)可使心肌細(xì)胞 miR-497表達(dá)下調(diào)60％，經(jīng) TUNEL、Hoechst33258染色以及應(yīng)用PI和AnnexinV染色流式細(xì)胞術(shù)分析，miR-497過表達(dá)可增加A/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，而miR-497低表達(dá)可減輕A/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。
　?。?）過表達(dá)miR-497可加重A/R誘導(dǎo)的線粒體膜電位降低，增加Caspase-3活性，從而使Bcl-2表達(dá)減少，Bax、cleaved