UC-MSC和ASC的生物學(xué)特性鑒別及對(duì)U251細(xì)胞的分化、凋亡的影響.pdf

1、本文主要分兩部分展開(kāi)研究：
　　第一部分 UC-MSC和ASC的生物學(xué)特性鑒別
　　目的：比較人臍帶和脂肪來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性。
　　方法：分離及體外培養(yǎng)人脂肪和臍帶來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞。通過(guò)連續(xù)9天的CCK-8的檢測(cè)結(jié)果繪制兩種間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。為了解ASC和UC-MSC的免疫表型，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD13、CD14、CD44、CD45、CD71、CD90、CD105和CD34在兩種MSC上的表達(dá)。利用地

2、塞米松誘導(dǎo)ASC和UC-MSC后，流式檢測(cè)Annexin-V的表達(dá)，分析MSCs的抗凋亡能力。通過(guò)成脂、成骨、成神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)兩種間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化，鑒定其多向分化的潛能。分別采用油紅O、茜素紅、GFAP染色鑒定是否分化成功。通過(guò)蛋白芯片分析ASC和UC-MSC的培養(yǎng)液上清的分泌的蛋白和細(xì)胞因子。
　　結(jié)果：脂肪來(lái)源和臍帶來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞都能成功從相關(guān)組織中分離培養(yǎng)。ASC和UC-MSC形態(tài)上相似，2天左右時(shí)呈現(xiàn)纖維狀或梭

3、形，當(dāng)6-10天后細(xì)胞密度增大時(shí)，呈現(xiàn)在平行排列生長(zhǎng)或旋渦狀生長(zhǎng)。ASC和UC-MSC均表達(dá)CD13、CD44、CD71、CD90、CD105，不表達(dá)CD14、CD34和CD45。生長(zhǎng)曲線顯示12-18h，細(xì)胞增殖較慢，2d后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，持續(xù)5-6d，在7-8d后進(jìn)入細(xì)胞生長(zhǎng)平臺(tái)期。在高濃度的地塞米松的誘導(dǎo)下，ASC和 UC-MSC都具有良好的抗凋亡能力。脂肪來(lái)源和臍帶來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞都具有很好的成脂、成骨、成神經(jīng)元的誘導(dǎo)分化能力

4、。在培養(yǎng)過(guò)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞和脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的上清中，兩種干細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子水平不盡相同。UC-MSC上清中的MIP-2、IL-6和GRO的表達(dá)顯著高于ASC，而ASC上清中的CD27和神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白含量則高于UC-MSC。
　　結(jié)論：脂肪來(lái)源和臍帶來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞均具有類似的生物學(xué)特性，但在誘導(dǎo)分化、增殖能力方面各有優(yōu)勢(shì)，所分泌的細(xì)胞因子水平也不盡相同，因此應(yīng)根據(jù)不同的需要選擇合適來(lái)源的干細(xì)胞。
　　第二部分 UC-M

5、SC和ASC條件培養(yǎng)基對(duì)U251細(xì)胞的分化、凋亡的影響
　　目的：了解兩種間充質(zhì)干細(xì)胞，ASC和UC-MSC的培養(yǎng)上清的抗膠質(zhì)瘤特性。
　　方法：通過(guò)CCK-8檢測(cè)UC-MSC和ASC的培養(yǎng)上清抑制U251的增殖能力。利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Annexin-V的表達(dá)分析UC-MSC和ASC的培養(yǎng)上清誘導(dǎo)U251后的凋亡程度。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)U251在誘導(dǎo)前后的凋亡相關(guān)基因的mRNA的表達(dá)量。通過(guò)高通量篩選系統(tǒng)評(píng)估膠質(zhì)細(xì)胞在分

6、化后的形態(tài)改變。劃痕試驗(yàn)、Matrigel侵襲試驗(yàn)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。通過(guò)蛋白芯片分析 U251細(xì)胞在ASC-CM和 UC-MSC-CM誘導(dǎo)前后蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：兩種類型的間充質(zhì)干細(xì)胞都能抑制U251細(xì)胞的增殖，特別是UC-MSC的抑制能力更強(qiáng)。Annxin-V和PI的凋亡檢測(cè)表明ASC-CM和UC-MSC-CM都能誘導(dǎo)U251細(xì)胞凋亡。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)表明誘導(dǎo)后U251的凋亡基因Caspase-3和Caspase-