新型組蛋白去乙?；敢种苿㏕CCT對U251和A549細胞的增殖、細胞周期及凋亡的影響.pdf

1、組蛋白乙?；揎検潜碛^遺傳學重要的組成部分，主要由組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases，HDACs)和組蛋白乙?；D移酶（histone acetyltransferases，HATs）催化完成，二者的調控共同維持著組蛋白乙?；癄顟B(tài)的平衡，此時基因的轉錄在一個相對穩(wěn)定可控的范圍內進行。一旦這種平衡被打破，如 HDACs發(fā)生過表達或 HATs活性降低將導致的組蛋白低乙?；@種情況下，低乙酰化的組蛋白與 DNA緊密結

2、合，染色體發(fā)生凝聚，轉錄因子與DNA的結合變得困難，基因的轉錄隨之受到抑制，這種乙?；癄顟B(tài)的改變導致的基因轉錄異常在誘導腫瘤發(fā)生中起到了重要作用。鑒于此，針對HDACs靶點的藥物—組蛋白去乙?；敢种苿℉DACi）的研究成為抗腫瘤領域的熱點和重要方向。2，2，3，3—四甲基環(huán)丙酰硫脲（TCCT）系在短鏈脂肪酸類HDACi——丙戊酸（VPA）進行結構改造而得到的衍生物，前期研究已發(fā)現其抑制U251及A549細胞中Ⅰ類HDACs——HDA

3、C3與Ⅱ類HDACs——HDAC4的表達[1]，屬新型HDACi。本課題組選取人腦膠質瘤U251與肺腺癌A549細胞為實驗對象，采用體外藥效學評價方法研究 TCCT的體外抗腫瘤作用，并對其抗腫瘤作用機制進行了初步探討，為能開發(fā)新型HDACi類抗腫瘤藥物奠定基礎。
　　目的：通過研究新型HDACi—TCCT對人腦膠質瘤U251細胞與人肺腺癌A549細胞增殖的影響、TCCT對U251與A549細胞細胞周期相關因子的表達的影響及TCCT

4、對U251與A549細胞周期進程及細胞凋亡的影響，探討TCCT的抗腫瘤作用及可能機制。
　　方法：人腦膠質瘤U251與人肺腺癌A549細胞分別用含10％胎牛血清(或小牛血清)的RPMI1640與DMEM高糖培養(yǎng)基置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細胞分TCCT不同濃度組與對照組處理。MTT法TCCT分0.075mmol/L、0.150 mmol/L、0.300mmol/L、0.600mmol/L、1.200mmol/L五個濃度組分別

5、處理兩株細胞，另設溶劑對照組及空白組；其他實驗方法TCCT分0.025mmol/L低、0.050 mmol/L中、1.000 mmol/L高劑量組分別處理兩株細胞，另設1.000 mmol/L VPA（丙戊酸）組及溶劑對照組。○1 MTT法研究TCCT對U251與A549細胞增值的影響（48h）；○2 RT-PCR檢測TCCT對U251與A549細胞細胞周期相關因子 mRNA表達的影響；○3 PI單染法檢測 TCCT對 U251與A54

6、9細胞周期的影響；○4 AnnexinⅤ-FITC法檢測TCCT對U251與A549細胞凋亡的影響；○5 Western Blot檢測TCCT對U251細胞特定位點乙酰化的組蛋白與細胞周期相關因子蛋白表達的影響；
　　結果：○1 MTT檢測，終濃度為0.075mmol/L、0.150mmol/L、0.300mmol/L、0.600mmol/L、1.200mmol/L的TCCT處理U251細胞48h后的抑制率分別為6.07%、17.

7、86%、32.68%、62.32%及84.29%，SPSS Probit(概率分布回歸)法得出半數抑制率IC50=0.461±0.108mmol/L；終濃度為0.075mmol/L、0.150mmol/L、0.300mmol/L、0.600mmol/L、1.200mmol/L的TCCT處理A549細胞48h后的抑制率分別為32.72%、49.85%、51.69%、61.77%及77.98%，SPSS Probit(概率分布回歸)法得出半

8、數抑制率IC50=0.215±0.068mmol/L。結果表明，TCCT對U251與A549細胞具有增殖抑制作用，且呈現劑量依賴性；○2 RT-PCR法顯示，相比溶劑對照組，TCCT低、中、高劑量組可上調U251細胞p21WAF1/CIP1 mRNA表達而下調CyclinD1 mRNA的表達；TCCT對A549細胞p21WAF1/CIP1 mRNA表達呈現弱上調作用，但對CyclinD1的表達幾乎沒有影響；○3 PI單染法檢測顯示，TC

9、CT作用24h后，U251細胞周期S期比例相比溶劑對照組的5.35±0.92%，低劑量組12.05±1.63%(p=0.264)、中劑量組19.40±2.55%(p=0.025)及高劑量組28.75±6.86%(p=0.003)的S期比例均顯著增高，VPA組7.40±0.28%(p=0.924)的S期比例變化不大，中劑量(p＜0.05)與高劑量組(p＜0.01)均具有統(tǒng)計學差異，VPA組p＞0.05無統(tǒng)計學意義，說明TCCT可誘使U25

10、1細胞發(fā)生細胞周期S期阻滯；A549細胞給藥組G2/M期比例相比溶劑對照組均有提高，中、高劑量組均有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)，說明TCCT可能誘使A549細胞發(fā)生G2/M期阻滯；○4 AnnexinⅤ-FITC法檢測結果表明，與U251細胞溶劑對照組凋亡率7.65±1.20%相比，低劑量組36.85±1.20%(p＜0.01)、中劑量組40.35±1.20%(p＜0.01)及高劑量組47.70±1.56%(p＜0.01)的凋亡率均顯著

11、增高，p＜0.01具有統(tǒng)計學意義，說明TCCT作用于U251細胞24h后能顯著誘導其發(fā)生細胞凋亡；對A549細胞中劑量(6.05±0.64%，p＜0.05)與高劑量組凋亡比例(8.05±0.49%，p＜0.01)具有統(tǒng)計學意義，低劑量組則不明顯，表明TCCT一定劑量可誘導A549細胞發(fā)生凋亡；○5 Western Blot結果表明，TCCT低、中及高劑量組對U251細胞賴氨酸9位乙?；M蛋白H3(Acetyl-Histone H3(Ly

12、s9))幾乎沒有上調作用，對賴氨酸16位乙?；M蛋白H4(Acetyl-Histone H4(Lys16))的表達顯示有一定的下調作用，對CyclinD1蛋白亦具有弱下調作用；
　　結論：○1新型HDACi—TCCT可有效抑制U251與A549細胞增殖，并呈現劑量依賴性；TCCT可誘導U251細胞發(fā)生S期阻滯及誘導細胞凋亡，可弱誘導A549細胞發(fā)生G2/M期阻滯，一定劑量下可誘導A549細胞發(fā)生凋亡；○2 TCCT抑制U251及A