糖皮質(zhì)激素抑制氣道上皮細(xì)胞修復(fù)的機(jī)制及干預(yù)研究.pdf

1、本文從以下幾部分進(jìn)行了詳細(xì)闡述。
　　第一部分糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的亮氨酸拉鏈蛋白(GILZ)在人氣道上皮細(xì)胞9HTE中的表達(dá)。
　　目的:明確糖皮質(zhì)激素(GCs)地塞米松(DEX)誘導(dǎo)GILZ在人氣道上皮細(xì)胞9HTE中的表達(dá)。
　　方法:RT-PCR及Western Blot法檢測(cè)DEX在不同時(shí)間點(diǎn)6小時(shí)、12小時(shí)及24小時(shí)作用后GILZ mRNA及蛋白的表達(dá)情況，同時(shí)細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)GILZ蛋白的定位。
　　結(jié)果

2、:正常情況下，GILZ mRNA及蛋白在人氣道上皮細(xì)胞9HTE的表達(dá)較低，而在DEX作用下GILZ mRNA及蛋白的表達(dá)均出現(xiàn)明顯改變，6小時(shí)即明顯增高，24小時(shí)仍持續(xù)高表達(dá)，同時(shí)觀察到GILZ蛋白在9HTE細(xì)胞中主要定位在細(xì)胞質(zhì)。
　　結(jié)論:DEX能夠快速并明顯誘導(dǎo)人氣道上皮細(xì)胞9HTE中GILZmRNA及蛋白的表達(dá)。
　　第二部分小干擾RNA(s-RNA)沉默GILZ的篩選及鑒定。
　　目的:通過si-RNA技術(shù)設(shè)

3、計(jì)合成三條GILZ siRNAs并篩選出GILZ沉默效果最佳的一條si-RNA用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　方法:設(shè)計(jì)并合成三條GILZ siRNAs:GILZ1 si-RNA、GILZ2 si-RNA及GILZ3 si-RNA，通過脂質(zhì)體2000分別轉(zhuǎn)染進(jìn)人氣道上皮細(xì)胞9HTE，于沉默48小時(shí)后，收集細(xì)胞用Realtime-PCR、Westem Blot及細(xì)胞免疫熒光法篩選并鑒定出沉默效果最佳的一條GILZ si-RNA。
　　結(jié)果

4、:通過對(duì)GILZ1 si-RNA、GILZ2 si-RNA及GILZ3 si-RNA三條GILZ siRNAs的轉(zhuǎn)染，篩選出GILZ3 si-RNA為最佳的一條GILZsi-RNA，Realtime-PCR檢測(cè)GILZ基因沉默效率平均可達(dá)55.8％，而通過Western Blot及細(xì)胞免疫熒光的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其蛋白沉默效果顯著。
　　結(jié)論:通過si-RNA技術(shù)，成功合成鑒定獲得一條沉默效果最佳的GILZ si-RNA，此為用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的

5、關(guān)鍵。
　　第三部分GILZ介導(dǎo)糖皮質(zhì)激素抑制氣道上皮細(xì)胞修復(fù)的研究。
　　目的:探討GILZ介導(dǎo)GCs對(duì)MAPK-ERK信號(hào)通路、增殖及遷移的影響，明確其對(duì)氣道上皮細(xì)胞修復(fù)的抑制作用。
　　方法:在non-specific si-RNA及GILZ si-RNA轉(zhuǎn)染48小時(shí)后收集細(xì)胞，Western Blot法檢測(cè)人氣道上皮細(xì)胞9HTE中Raf-1、Mek1/2、Erk1/2（MAPK-ERK信號(hào)通路因子）磷酸化蛋白及

6、其總蛋白的表達(dá)， MTT、CFSE標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，細(xì)胞劃痕及transwell法檢測(cè)細(xì)胞遷移情況。
　　結(jié)果:DEX抑制了人氣道上皮細(xì)胞9HTE中MAPK-ERK信號(hào)通路Raf-1、Mek1/2、Erk1/2磷酸化蛋白的表達(dá)，而對(duì)總蛋白的表達(dá)無明顯影響，即抑制了MAPK-ERK信號(hào)通路的激活，同時(shí)也觀察到DEX抑制了細(xì)胞的增殖和遷移。而GILZ si-RNA轉(zhuǎn)染進(jìn)人氣道上皮細(xì)胞9HTE，GILZ的表達(dá)被抑制后，DEX對(duì)氣道

7、上皮細(xì)胞MAPK-ERK信號(hào)通路、增殖及遷移的抑制作用均明顯減輕。
　　結(jié)論:DEX能夠抑制MAPK-ERK信號(hào)通路的激活、增殖及遷移，從而抑制了氣道上皮細(xì)胞的修復(fù)作用，而DEX的這一抑制作用主要是通過GILZ介導(dǎo)的。
　　第四部分維生素A對(duì)糖皮質(zhì)激素抑制氣道上皮細(xì)胞修復(fù)的干預(yù)研究。
　　目的:明確維生素A(VitA)在人氣道上皮細(xì)胞9HTE中對(duì)GCs抑制氣道上皮細(xì)胞修復(fù)的影響。
　　方法:通過DEX及全反式維甲

8、酸(ATRA)2干預(yù)24h后，ELISA法檢測(cè)人氣道上皮細(xì)胞9HTE培養(yǎng)上清液中EGF的表達(dá)，細(xì)胞免疫熒光及 Western Blot法檢測(cè)EGFR及磷酸化EGFR的表達(dá);同時(shí)Western Blot檢測(cè)人氣道上皮細(xì)胞9HTE中Raf-1、Mek1/2、Erk1/2（MAPK-ERK信號(hào)通路因子）磷酸化蛋白及其總蛋白的表達(dá)，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，細(xì)胞劃痕及transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移情況。
　　結(jié)果:ATRA對(duì)人氣道上皮

9、細(xì)胞9HTE EGF的分泌無明顯影響，但對(duì)EGFR及其磷酸化的蛋白的表達(dá)有促進(jìn)作用。ATRA同時(shí)也增加了MAPK-ERK信號(hào)通路Raf-1、Mek1/2、Erk1/2磷酸化蛋白的表達(dá)從而減輕了DEX對(duì)MAPK-ERK信號(hào)通路激活的抑制作用;ATRA在早期對(duì)細(xì)胞增殖無明顯影響，但明顯促進(jìn)了9HTE細(xì)胞的遷移。
　　結(jié)論:ATRA能夠誘導(dǎo)EGFR磷酸化蛋白的表達(dá)從而激活EGFR信號(hào)通路，這也激活了下游的MAPK-ERK信號(hào)通路并促進(jìn)了