新型融合蛋白系統(tǒng)用于定量檢測(cè)多種蛋白酶活性.pdf

1、蛋白酶在細(xì)胞和病毒中起重要作用，一些專一性蛋白酶用于去除用于大腸桿菌重組表達(dá)和親和純化的融合標(biāo)簽。研究不同蛋白酶的專一性和抑制劑對(duì)于疾病治療以及開發(fā)工程用蛋白酶至關(guān)重要，大腸桿菌重組表達(dá)系統(tǒng)因生長(zhǎng)速度快，易于操作和體系廉價(jià)成為研究體內(nèi)和體外篩選蛋白酶突變體和抑制劑的首選。多種蛋白底物已用于指示不同蛋白酶的活性，但是存在范圍窄和分析手段繁瑣等缺點(diǎn)，為此本研究開發(fā)新型用于多種蛋白酶活性測(cè)定的融合蛋白底物系統(tǒng)，利用蛋白酶切除融合標(biāo)簽進(jìn)而提高靶

2、蛋白的酶活，通過(guò)耦聯(lián)法測(cè)定蛋白酶活性，獲得以下結(jié)果：
　　1.分別構(gòu)建了含七種不同的蛋白酶切割序列(人鼻病毒3C蛋白，煙草蝕斑病毒蛋白酶，Xa因子，Ssp DnaB內(nèi)含肽，Sce VMA1內(nèi)含肽，凝血酶和腸激酶)的融合蛋白，其中融合蛋白上游含有不同的標(biāo)簽(His6，GST，纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域和MBP標(biāo)簽)下游分別含有和大腸桿菌和傷寒沙門氏菌2.3-二氨基丙氨脫氨酶(2.3-diaminopropionate ammonia-lyas

3、e，DAL)。
　　2.利用SDS-PAGE和蛋白印跡分別研究不同融合蛋白在大腸桿菌的表達(dá)，MBP融合表達(dá)在提高融合蛋白在大腸桿菌的表達(dá)最為有效。
　　3.研究了一些不同蛋白酶抑制劑對(duì)大腸桿菌DAL(eDAL)活性的影響，結(jié)果表明它們對(duì)eDAL活性沒有明顯抑制作用。
　　4.分析了表達(dá)上清的大腸桿菌DAL(eDAL)和傷寒沙門氏菌DAL(sDAL)活性，結(jié)果表明不同標(biāo)簽對(duì)酶活性的抑制效果不同。
　　5.分別分析了

4、煙草蝕斑病毒蛋白酶和Xa因子裂解相應(yīng)破碎上清液和純化的融合蛋白底物活性，在相應(yīng)的蛋白酶抑制劑作用下，蛋白酶活性明顯降低。
　　6.凝血酶對(duì)兩種不同序列的融合蛋白切割效率不同，抑制劑不能去除這種裂解效率差異性。
　　7.腸激酶能夠切割eDAL，卻不裂解sDAL，上清和純化的融合蛋白可作為腸激酶底物，抑制劑降低腸激酶活性。
　　8.僅有MBP標(biāo)簽對(duì)提高含有人鼻病毒3C蛋白酶作用序列的eDAL的表達(dá)水平比GST標(biāo)簽更有效，上

5、清和純化的MBP融合蛋白被人鼻病毒3C蛋白酶裂解，但活性受抑制劑影響。
　　9.純化的含有Ssp DnaB內(nèi)含肽融合蛋白可以用于檢測(cè)不同溫度下自降解效率。
　　10. SUMO融合的eDAL可有效被構(gòu)建的SUMO蛋白酶在胞內(nèi)和胞外裂解，胞內(nèi)蛋白酶活性與表達(dá)蛋白酶的水溶性成正相關(guān)。
　　綜上所述：本研究設(shè)計(jì)的基于DAL的融合蛋白系統(tǒng)可用于定量分析序列專一性和構(gòu)象依賴專一性的蛋白酶，并首次獲得定量檢測(cè)自我剪切的蛋白酶底物。