新型融合蛋白系統(tǒng)用于定量檢測多種蛋白酶活性.pdf

1、蛋白酶在細胞和病毒中起重要作用，一些專一性蛋白酶用于去除用于大腸桿菌重組表達和親和純化的融合標簽。研究不同蛋白酶的專一性和抑制劑對于疾病治療以及開發(fā)工程用蛋白酶至關重要，大腸桿菌重組表達系統(tǒng)因生長速度快，易于操作和體系廉價成為研究體內和體外篩選蛋白酶突變體和抑制劑的首選。多種蛋白底物已用于指示不同蛋白酶的活性，但是存在范圍窄和分析手段繁瑣等缺點，為此本研究開發(fā)新型用于多種蛋白酶活性測定的融合蛋白底物系統(tǒng)，利用蛋白酶切除融合標簽進而提高靶

2、蛋白的酶活，通過耦聯(lián)法測定蛋白酶活性，獲得以下結果：
　　1.分別構建了含七種不同的蛋白酶切割序列(人鼻病毒3C蛋白，煙草蝕斑病毒蛋白酶，Xa因子，Ssp DnaB內含肽，Sce VMA1內含肽，凝血酶和腸激酶)的融合蛋白，其中融合蛋白上游含有不同的標簽(His6，GST，纖維素結合結構域和MBP標簽)下游分別含有和大腸桿菌和傷寒沙門氏菌2.3-二氨基丙氨脫氨酶(2.3-diaminopropionate ammonia-lyas

3、e，DAL)。
　　2.利用SDS-PAGE和蛋白印跡分別研究不同融合蛋白在大腸桿菌的表達，MBP融合表達在提高融合蛋白在大腸桿菌的表達最為有效。
　　3.研究了一些不同蛋白酶抑制劑對大腸桿菌DAL(eDAL)活性的影響，結果表明它們對eDAL活性沒有明顯抑制作用。
　　4.分析了表達上清的大腸桿菌DAL(eDAL)和傷寒沙門氏菌DAL(sDAL)活性，結果表明不同標簽對酶活性的抑制效果不同。
　　5.分別分析了

4、煙草蝕斑病毒蛋白酶和Xa因子裂解相應破碎上清液和純化的融合蛋白底物活性，在相應的蛋白酶抑制劑作用下，蛋白酶活性明顯降低。
　　6.凝血酶對兩種不同序列的融合蛋白切割效率不同，抑制劑不能去除這種裂解效率差異性。
　　7.腸激酶能夠切割eDAL，卻不裂解sDAL，上清和純化的融合蛋白可作為腸激酶底物，抑制劑降低腸激酶活性。
　　8.僅有MBP標簽對提高含有人鼻病毒3C蛋白酶作用序列的eDAL的表達水平比GST標簽更有效，上

5、清和純化的MBP融合蛋白被人鼻病毒3C蛋白酶裂解，但活性受抑制劑影響。
　　9.純化的含有Ssp DnaB內含肽融合蛋白可以用于檢測不同溫度下自降解效率。
　　10. SUMO融合的eDAL可有效被構建的SUMO蛋白酶在胞內和胞外裂解，胞內蛋白酶活性與表達蛋白酶的水溶性成正相關。
　　綜上所述：本研究設計的基于DAL的融合蛋白系統(tǒng)可用于定量分析序列專一性和構象依賴專一性的蛋白酶，并首次獲得定量檢測自我剪切的蛋白酶底物。