ATP-P2X4信號(hào)軸介導(dǎo)NLRP3炎性體的活化-一種糖尿病腎病腎間質(zhì)炎癥發(fā)生的新途徑.pdf

1、1、前言
　　糖尿病腎病(DiabeticNephropathy,DN)是導(dǎo)致終末期腎臟疾病的主要病因。腎間質(zhì)炎癥反應(yīng)是糖尿病腎病的重要病理生理基礎(chǔ)。IL-1家族細(xì)胞因子是糖尿病腎病炎癥反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)器,與糖尿病各種慢性并發(fā)癥具有直接關(guān)系。IL-1β和IL-18等IL-1家族細(xì)胞因子前體分子必須依賴Caspase-1的剪切作用才能發(fā)揮生物學(xué)作用。研究發(fā)現(xiàn)NLRP3炎性體作為胞內(nèi)危險(xiǎn)相關(guān)分子模式(DAMPs)的感受器,通過(guò)激活Cas

2、pase-1調(diào)控IL-1β、IL-18等細(xì)胞因子的成熟和分泌,引發(fā)糖尿病、肥胖癥、痛風(fēng)等代謝相關(guān)性疾病中的炎癥。有研究發(fā)現(xiàn)NLRP3基因敲除后腎臟UUO和缺血再灌注小鼠模型腎小管損傷和腎間質(zhì)炎癥反應(yīng)顯著減輕。最新研究發(fā)現(xiàn)STZ糖尿病大鼠腎臟組織中NLRP3炎性體被激活。阻斷其活化能明顯減輕腎組織炎癥反應(yīng),改善腎臟功能。這些證據(jù)提示NLRP3炎性體在調(diào)控腎臟無(wú)菌性炎癥過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。目前糖尿病腎病時(shí)NLRP3炎性體的活化機(jī)制尚不清楚。

3、
　　P2X受體活化介導(dǎo)ATP、二聚糖、淀粉樣蛋白等內(nèi)源性DAMPs激活NLRP3炎性體,調(diào)控過(guò)敏癥、急性胰腺炎和癌癥等疾病中的無(wú)菌性炎癥反應(yīng),影響患者的療效和預(yù)后。P2X受體是P2受體家族中的一類配體門控離子通道受體,共有七個(gè)成員(P2X1-7)。除了P2X3以外的6種P2X受體亞型在腎臟中均有表達(dá)。腎小管上皮細(xì)胞上主要表達(dá)P2X4和P2X6。生理狀態(tài)下,P2X受體的活化能促進(jìn)腎臟鈉水排泄和調(diào)控腎臟的血流量。ATP是P2X受體的

4、激動(dòng)劑。糖尿病時(shí),高糖依賴細(xì)胞外ATP(eATP)激活腎小球系膜細(xì)胞上P2X7受體,上調(diào)TGF-β和細(xì)胞外基質(zhì)的表達(dá)。高糖還可以依賴細(xì)胞外ATP引起視網(wǎng)膜細(xì)胞caspase-1的活化和IL-1β的分泌。本研究旨在探明ATP-P2X4信號(hào)軸在糖尿病腎病腎間質(zhì)炎癥反應(yīng)中的作用,為解析糖尿病腎病腎臟炎癥的發(fā)病機(jī)制以及尋找防治糖尿病腎病的新措施提供理論依據(jù)。
　　2、方法:
　　2.1、臨床病例
　　選取2011年1月至201

5、2年6月重慶大坪醫(yī)院腎內(nèi)科收治的2型糖尿病腎病患者45例,納入標(biāo)準(zhǔn)為:40-70歲;有2型糖尿病病史;24h尿蛋白﹥150mg;經(jīng)腎活檢病理診斷為糖尿病腎病;不包括發(fā)燒或有明顯感染病灶,以及高尿酸患者;所有病例使用胰島素控制血糖,利用血管緊張素拮抗劑和CCB類降壓藥控制血壓,以及他汀類控制血脂,在行腎活檢3月內(nèi)未服用任何中藥或者格列苯脲等降糖藥。對(duì)照組為11例腎錯(cuò)構(gòu)瘤患者,其腎組織標(biāo)本均取自切除腎臟的遠(yuǎn)離腫瘤部分經(jīng)病理檢查為正常腎組織。

6、
　　常規(guī)生化方法測(cè)定血清總膽固醇、低密度膽固醇、SCr、24h尿蛋白定量,并根據(jù)公式計(jì)算eGFR值。利用免疫熒光和免疫組化檢測(cè)患者腎小管P2X4、NLRP3、IL-1β、IL-18的表達(dá)情況。并分析腎小管上皮細(xì)胞P2X4、NLRP3和尿IL-1β、IL-18水平之間的相關(guān)性。
　　2.2、細(xì)胞培養(yǎng)
　　HK-2細(xì)胞,作為一種腎小管上皮細(xì)胞株,培養(yǎng)于含胎牛血清10％的低糖DMEM培養(yǎng)基。HK-2細(xì)胞在無(wú)血清DMEM中靜

7、止12h,1)分別以35mMD-glucose或5mMD-glucose+30mM甘露醇作用于HK-2細(xì)胞0、12、24、48、72小時(shí);2)分別培養(yǎng)于正常糖濃度,高糖濃度,高甘露醇濃度,作用48小時(shí)。分別利用apyrase(eATP水解酶),suramin(P2受體拮抗劑),TNP-ATP(P2X受體拮抗劑),或者5-BDBD(P2X4受體拮抗劑)和35mMD-glucose共同作用于HK-2細(xì)胞48h。
　　利用ATP熒光素檢

8、測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞上清液中ATP的表達(dá)水平。利用PBFI-AM檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鉀離子濃度,利用Fluo-3/AM檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度。利用westernblot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)NLRP3、細(xì)胞上清液中成熟的caspase-1和IL-1β的表達(dá),利用ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清液中IL-1β和IL-18的水平。
　　2.3、細(xì)胞轉(zhuǎn)染
　　分別以脂質(zhì)體Lipofectamine?2000加對(duì)照Green-FluoresceinConjugate對(duì)照

9、siRNA、無(wú)熒光標(biāo)記對(duì)照siRNA、或者P2X4siRNA,轉(zhuǎn)染腎小管上皮細(xì)胞24h后,進(jìn)行高糖刺激48h。
　　利用PBFI-AM檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鉀離子濃度,利用Fluo-3/AM檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度。利用westernblot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)NLRP3、細(xì)胞上清液中成熟的caspase-1和IL-1β的表達(dá),利用ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清液中IL-1β和IL-18的水平。
　　3、結(jié)果:
　　3.1、腎小管上皮細(xì)胞P2X4表達(dá)與

10、DN腎間質(zhì)炎癥相關(guān)
　　2型糖尿病腎病患者腎小管上皮細(xì)胞P2X4和NLRP3表達(dá)水平明顯升高。P2X4和NLRP3的免疫組化表達(dá)評(píng)分分別和尿IL-1β、IL-18水平均呈正相關(guān)關(guān)系。免疫熒光結(jié)果顯示P2X4的表達(dá)分別和NLRP3、IL-1β、IL-18蛋白呈共定位現(xiàn)象。
　　3.2、高糖依賴細(xì)胞外ATP激活NLRP3炎性體
　　高糖刺激下HK-2細(xì)胞內(nèi)NLRP3的表達(dá)、細(xì)胞上清液中成熟的caspase-1和IL-1β的

11、表達(dá)、以及細(xì)胞分泌IL-1β、IL-18和ATP的水平呈明顯劑量和時(shí)間依賴性升高。Apyrase消耗掉細(xì)胞外ATP,能完全阻斷高糖上調(diào)NLRP3、成熟的caspase-1、IL-1β和總IL-1β、IL-18的表達(dá)。
　　3.3、高糖引起HK-2細(xì)胞的ATP-P2X4信號(hào)軸活化
　　高糖刺激導(dǎo)致HK-2細(xì)胞內(nèi)鉀離子濃度濃度明顯下降,鈣離子濃度明顯上升。Apyrase能夠明顯抑制高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞內(nèi)鉀離子濃度的降低和鈣離子

12、濃度的升高。Suramin、TNP-ATP、5-BDBD均能顯著抑制高糖引起細(xì)胞內(nèi)鉀離子濃度的降低。TNP-ATP、5-BDBD均能抑制高糖引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的升高。
　　3.4、P2X4受體介導(dǎo)高糖激活NLRP3炎性體
　　Suramin、TNP-ATP以及5-BDBD均能夠明顯抑制高糖上調(diào)NLRP3、成熟的caspase-1、IL-1β和總IL-1β、IL-18的表達(dá)。P2X4siRNA轉(zhuǎn)染能夠明顯抑制的高糖引起的細(xì)胞