Bufalin、β-欖香烯和PS-341對(duì)腎細(xì)胞癌的抗腫瘤作用及機(jī)理研究.pdf

1、目的：
　　 腎細(xì)胞癌約占成人惡性腫瘤的3％，發(fā)病時(shí)約30%病例為晚期。由于腎癌細(xì)胞高度表達(dá)耐藥基因，故對(duì)常規(guī)的化療無(wú)效。晚期腎癌的治療以免疫治療為主，但有效率僅10%左右。近年來(lái)開(kāi)發(fā)的新型分子靶向藥物如舒尼替尼和索拉菲尼等，使得晚期腎癌的療效有了一定提高，但由于價(jià)格昂貴，多數(shù)患者難以負(fù)擔(dān)。因此，有必要尋找高效低毒，且價(jià)格相對(duì)低廉的新型抗腫瘤藥物，以進(jìn)一步提高晚期腎癌的療效。
　　 Bufalin和欖香烯(elemene

2、)是從中藥中提取的抗癌有效成分，可抑制多種腫瘤細(xì)胞(如肺癌、結(jié)腸癌和膠質(zhì)瘤)的增殖。但關(guān)于它們對(duì)腎癌有無(wú)抗腫瘤作用目前尚不清楚。硼替佐米(bortezomib，PS-341)是一種新型蛋白酶體抑制劑，已被美國(guó)食品與藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)用于多發(fā)性骨髓瘤和套細(xì)胞淋巴瘤的治療。小樣本臨床研究結(jié)果提示硼替佐米對(duì)轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌有效，但其具體抗腫瘤作用及機(jī)制需要進(jìn)一步研究。
　　 細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)增殖及凋亡的信號(hào)通路主要有核因子-κB(nuc

3、lear factor-κB，NF-κB)通路、絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases，MAPK)通路和PI3K/Akt/mTOR通路等。這些信號(hào)傳導(dǎo)通路的活性對(duì)藥物的抗腫瘤作用具有重要的影響，抗癌藥物可通過(guò)改變這些通路的活性抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)凋亡。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，位于Akt的下游，能激

4、活p70S6K1等來(lái)增強(qiáng)mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯，進(jìn)而增加一系列細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)蛋白的表達(dá)，引起細(xì)胞快速增殖。目前NCCN指南推薦的用于治療轉(zhuǎn)移性腎癌的藥物中有兩種是mTOR抑制劑，可見(jiàn)mTOR是治療腎癌的重要靶點(diǎn)。mTOR還是自噬的負(fù)性調(diào)控因子，抑制mTOR活性可誘導(dǎo)自噬發(fā)生。研究表明一些抗腫瘤藥物在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的同時(shí)可激活自噬反應(yīng)，抑制自噬可增強(qiáng)藥物的抗腫瘤作用。目前藥物誘導(dǎo)的保護(hù)性自噬已成為腫瘤耐藥的研究熱點(diǎn)。
　　 本研究以腎透

5、明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞為模型，探討新型抗腫瘤藥物bufalin，β-欖香烯和PS-341對(duì)786-0細(xì)胞活力，凋亡及周期分布的影響，并進(jìn)一步研究藥物對(duì)細(xì)胞內(nèi)NF-κB、MAPK和PI3K/Akt/mTOR通路活性的影響，以及對(duì)自噬的影響，以尋找治療腎癌的有效藥物。
　　 材料與方法：
　　 1.采用MTT方法測(cè)定細(xì)胞活力，繪制生存曲線。
　　 2.采用流式細(xì)胞術(shù)PI染色進(jìn)行細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期檢測(cè)。
　　

6、3.采用Western blot法檢測(cè)蛋白的表達(dá)。
　　 4.采用透射電鏡技術(shù)觀察自噬的形態(tài)學(xué)變化。
　　 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間差異采用Student's ttest分析。P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 一、Bufalin、β-欖香烯和PS-341對(duì)腎細(xì)胞癌的抗腫瘤作用
　　 (一)傳統(tǒng)化療藥物及生物制劑對(duì)786-0細(xì)胞活力的影響
　　 不同

7、濃度的阿霉素(ADM)、順鉑(CDDP)作用于786-0細(xì)胞24 h，氟尿嘧啶(5-FU)作用于786-0細(xì)胞48 h，細(xì)胞活力僅輕度受抑制。與此類似，不同濃度的TNF和IL-2處理細(xì)胞24或48 h，細(xì)胞活力無(wú)明顯變化。
　　 (二)Bufalin、β-欖香烯及PS-341對(duì)786-0細(xì)胞活力的影響
　　 不同濃度的bufalin作用于786-0細(xì)胞24、48和72 h，抑制細(xì)胞50%的藥物濃度(IC50)分別為77.

8、62 nmol/L、24.46 nmol/L和14.43 nmol/L；β-欖香烯在24、48和72 h的IC50分別為145.60μg/mL，126.90μg/mL和63.84μg/mL；PS-341作用24 h細(xì)胞活力無(wú)明顯變化，48和72 h的IC50分別為55.17 nmol/L和19.93 nmol/L。這些數(shù)據(jù)提示bufalin，β-欖香烯和PS-341對(duì)腎癌786-0細(xì)胞有明顯的增殖抑制作用。
　　 (三)Bufa

9、lin、β-欖香烯及PS-341對(duì)786-0細(xì)胞凋亡及周期分布的影響
　　 流式細(xì)胞分析術(shù)結(jié)果顯示，bufalin和β-欖香烯作用786-0細(xì)胞24h后，凋亡細(xì)胞百分比明顯升高，與正常對(duì)照組相比P直均<0.05；G2/M期細(xì)胞比例無(wú)明顯變化。PS-341作用于細(xì)胞24或48 h，凋亡細(xì)胞百分比無(wú)明顯變化，而G2/M期細(xì)胞比例明顯升高，P<0.05。
　　 (四)Bufalin、β-欖香烯及PS-341對(duì)786-0細(xì)胞凋亡

10、相關(guān)蛋白表達(dá)的影響
　　 80 nmol/L的bufalin作用786-0細(xì)胞24 h，PARP明顯裂解，Bax/Bcl-2比值升高；150μg/mL的β-欖香烯作用細(xì)胞24 h后也可見(jiàn)PARP裂解，Bcl-2及Survivin蛋白表達(dá)下降，Bax表達(dá)無(wú)明顯變化；50 nmol/L的PS-341作用細(xì)胞24和48 h，PARP僅輕度裂解，Bcl-2、Bax表達(dá)無(wú)明顯變化，Survivin表達(dá)升高。
　　 二、Bufali

11、n、β-欖香烯和PS-341對(duì)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路的影響
　　 (一)Bufalin、β-欖香烯和PS-341對(duì)786-0細(xì)胞NF-κB通路活性的影響
　　 Bufalin、β-欖香烯作用786-0細(xì)胞不同時(shí)間，IκBα蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯變化，而PS-341作用后IKBa表達(dá)逐漸增加，提示bufalin和β-欖香烯對(duì)NF-κB通路活性無(wú)影響，而PS-341可抑制NF-KB通路活性。
　　 (二)Bufalin、β-

12、欖香烯和PS-341對(duì)ERK及JNK通路活性的影響
　　 Bufalin、β-欖香烯和PS-341均可一過(guò)性活化ERK通路，其中β-欖香烯和PS-341作用后ERK活性逐漸下調(diào)，之后低于正常水平，而bufalin對(duì)ERK活性無(wú)明顯抑制作用。Bufalin和β-欖香烯均可一過(guò)性活化JNK通路，而PS-341作用至24-48 h才明顯活化JNK通路。這些結(jié)果提示，ERK及JNK通路參與了三種藥物對(duì)786-0細(xì)胞的抗腫瘤過(guò)程。

13、　　 (三)Bufalin、β-欖香烯和PS-341對(duì)786-0細(xì)胞PI3K/Akt/mTOR通路活性的影響
　　 Bufalin、β-欖香烯和PS-341作用細(xì)胞后，p-Akt、p-mTOR及p-p70S6K1水平逐漸下降，至24或48 h明顯低與正常對(duì)照細(xì)胞，提示三種藥物通過(guò)抑制PI3K/Akt/mTOR通路活性發(fā)揮對(duì)腎癌細(xì)胞的抗腫瘤作用。
　　 三、藥物誘導(dǎo)的保護(hù)性自噬拮抗對(duì)腎癌細(xì)胞的抗腫瘤作用
　　 (

14、一)Bufalin、β-欖香烯和PS-341對(duì)LC3蛋白表達(dá)的影響
　　 Bufalin、β-欖香烯和PS-341作用786-0細(xì)胞24 h后，LC3-Ⅱ的表達(dá)水平明顯升高，LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ的比值升高，提示自噬反應(yīng)發(fā)生。
　　 (二)Bufalin、β-欖香烯和PS-341誘導(dǎo)自噬小體形成
　　 Bufalin、β-欖香烯和PS-341作用細(xì)胞24 h，電鏡下可觀察到自噬小體，表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)的雙層膜小泡明顯增

15、多，泡內(nèi)可見(jiàn)被吞噬的細(xì)胞內(nèi)容物，此為自噬的典型形態(tài)學(xué)變化，提示藥物作用后可誘導(dǎo)自噬反應(yīng)發(fā)生。
　　 (三)抑制自噬對(duì)藥物抗腫瘤活性的影響
　　 自噬抑制劑3MA或氯喹(CQ)預(yù)處理細(xì)胞1 h，再加入bufalin、β-欖香烯或PS-341繼續(xù)作用24或48 h，同藥物單獨(dú)處理組相比，加入自噬抑制劑可明顯降低細(xì)胞活力，提示抑制自噬可增強(qiáng)藥物的抗腫瘤活性。
　　 結(jié)論
　　 1.786-0細(xì)胞對(duì)傳統(tǒng)化療藥物及

16、生物制劑耐藥，而新型抗腫瘤藥物bufalin、β-欖香烯和PS-341對(duì)細(xì)胞有明顯的增殖抑制作用。
　　 2.Bufalin和β-欖香烯通過(guò)下調(diào)抗凋亡蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)786-0細(xì)胞凋亡；PS-341主要誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯，對(duì)凋亡無(wú)明顯影響。
　　 3.Bufalin、β-欖香烯和PS-341通過(guò)影響ERK和JNK通路活性，發(fā)揮對(duì)細(xì)胞的抗腫瘤作用；Bufalin和β-欖香烯對(duì)NF-κB通路活性無(wú)明顯影響，而PS-34