多發(fā)性骨髓瘤相關(guān)基因DAZAP2啟動(dòng)子甲基化初步研究及抗DAZAP2多克隆抗體制備.pdf

1、多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是漿細(xì)胞異常增生的惡性腫瘤。為了尋找多發(fā)性骨髓瘤相關(guān)基因,本課題組利用基因芯片技術(shù)分析MM患者和正常人單個(gè)核細(xì)胞基因表達(dá)譜,結(jié)果顯示DAZAP2(Deleted in azoospermia associated protein2)基因表達(dá)明顯下調(diào),并通過(guò)RT-PCR、Western blotting等實(shí)驗(yàn)證明。為了明確DAZAP2基因表達(dá)下調(diào)機(jī)制,我們對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)

2、DAZAP2基因啟動(dòng)子區(qū)域中存在兩個(gè)CpG島(CpG1、CpG2),并且呈現(xiàn)高密度甲基化狀態(tài)。進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證明,CpG2甲基化后DAZAP2基因啟動(dòng)子活性明顯下降。
　　 為了闡明MM中DAZAP2基因表達(dá)下調(diào)的表觀遺傳學(xué)機(jī)制,我們應(yīng)用TFSEARCH軟件分析DAZAP2基因啟動(dòng)子區(qū)域中CpG2,發(fā)現(xiàn)HSF、p300、CREB、ADRI等一些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。同時(shí),結(jié)合亞硫酸鹽-基因組測(cè)序法(Bisulphitegenomic

3、-sequencing,BGS)獲得的DAZAP2啟動(dòng)子區(qū)域中的甲基化位點(diǎn),挑選出AP-2、CREB、c-Rel三個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。用生物素5’端標(biāo)記AP-2、CREB、c-Rel非甲基化(甲基化)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)探針,提取KM3細(xì)胞核蛋白,進(jìn)行凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)(electrophoretic mobility shitt assay,EMSA)。實(shí)驗(yàn)證實(shí),通過(guò)甲基化結(jié)合位點(diǎn)中的胞嘧啶,能夠抑制某些轉(zhuǎn)錄因子與其結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合,導(dǎo)致基因表達(dá)

4、下調(diào)。
　　 為了將DAZAP2的檢測(cè)應(yīng)用到臨床,建立MM臨床診斷輔助手段,我們擬構(gòu)建DAZAP2蛋白質(zhì)檢測(cè)方法,首先:將DAZAP2與原核表達(dá)載體pQE30重組,并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109,用1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)pQE30-DAZAP2/JM109表達(dá)融合蛋白。經(jīng)Ni-NTA親和層析柱純化,透析處理,SDS-PAGE17 KD位置有明顯條帶。用純化蛋白免疫大白兔,常規(guī)免疫后,采用ELISA和Westernbl