亞低溫對(duì)顱腦創(chuàng)傷微環(huán)境下溫敏臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化特性影響的研究.pdf

1、目的:從物理和化學(xué)微環(huán)境的角度探討亞低溫對(duì)顱腦損傷(TBI)后移植溫敏臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(tsUC)分化特性的影響。
　　方法:
　　1、溫敏臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的建立、培養(yǎng):從新生兒臍帶中分離培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(UC);通過(guò)感染攜溫度敏感型猿猴病毒40大T抗原(ts-SV40LT)基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒來(lái)制備tsUC，并于正常培養(yǎng)溫度(NT，37℃)和亞低溫(MHT，33℃)條件下分別培養(yǎng)。
　　2、模擬腦組織彈性模量制備二維

2、培養(yǎng)基質(zhì):利用單丙烯酰胺和雙丙烯酰胺的聚合作用，按不同濃度配比制備出不同彈性模量的聚丙烯酰胺(PA)水凝膠;應(yīng)用力學(xué)試驗(yàn)機(jī)拉伸檢測(cè)水凝膠的彈性，并篩選出類似于腦組織和顱腦損傷后腦組織（近似于肌肉組織）彈性模量的聚丙烯酰胺水凝膠;按相應(yīng)的濃度配比，制備模擬腦組織和肌肉組織彈性模量的二維培養(yǎng)基質(zhì)。
　　3、亞低溫(MHT)對(duì)正常腦組織及TBI腦組織物理微環(huán)境下tsUC的影響:實(shí)驗(yàn)分為5組:對(duì)照組（Sham組）、UC+NT+0.5kPa

3、組、tsUC+MHT+0.5kPa組、UC+NT+8.0kPa組、tsUC+MHT+8.0kPa組。其中Sham組為玻片上常規(guī)培養(yǎng)UC，其余4組分別按細(xì)胞種類、培養(yǎng)基彈性模量及培養(yǎng)溫度區(qū)分。動(dòng)態(tài)觀察各組細(xì)胞的生長(zhǎng)情況和形態(tài)變化，7天后行免疫熒光檢測(cè)各組細(xì)胞的分化水平，對(duì)于分化的神經(jīng)元用Image J軟件計(jì)算其軸突長(zhǎng)度。
　　4、亞低溫后TBI腦組織化學(xué)微環(huán)境對(duì)UC的影響:應(yīng)用電子腦皮質(zhì)挫傷撞擊儀制作大鼠TBI模型，給予全身亞低溫處

4、理4h后，獲取大鼠模型損傷區(qū)域腦組織的提取液，同樣獲得單純TBI及假手術(shù)組大鼠的腦組織提取液。模擬腦組織彈性模量制備聚丙烯酰胺水凝膠，將分離培養(yǎng)的UC置于上述水凝膠上培養(yǎng)，分別加入三種大鼠的腦組織勻漿液，由此分為UC+Sham、UC+TBI、UC+TBI+MHT三組，24 h后檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡水平，并更換為UC的正常培養(yǎng)基。7天后行細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)其向神經(jīng)元分化的水平。
　　5、亞低溫聯(lián)合tsUC移植對(duì)TBI大鼠神經(jīng)功能的修復(fù):

5、將SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham組）、注射PBS組（TBI+PBS組）、溫敏臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植組（TBI+tsUC組）、亞低溫+溫敏臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植組（TBI+MHT+tsUC組），除Sham組和TBI+PBS組外，均采用立體定向技術(shù)將預(yù)先行BrdU標(biāo)記的干細(xì)胞注射到損傷處腦組織周圍（TBI+PBS組注射等量PBS），其中TBI+MHT+tsUC組的大鼠在造模完成后立即行亞低溫治療，待體溫降至33℃后行干細(xì)胞移植。傷后第3天采

6、用干濕比重法測(cè)定腦組織含水量，傷后24小時(shí)、3天、7天分別行神經(jīng)學(xué)缺損評(píng)分，7天后腦組織取材測(cè)定損傷體積，并行細(xì)胞免疫熒光評(píng)價(jià)移植干細(xì)胞的存活情況。
　　結(jié)果:
　　1、UC和tsUC的培養(yǎng)和鑒定結(jié)果:UC的流式細(xì)胞分析檢測(cè)結(jié)果顯示，細(xì)胞表面抗原的表達(dá)符合UC的特征，UC細(xì)胞的純度為97.91％，生長(zhǎng)、增殖活性較強(qiáng)。經(jīng)轉(zhuǎn)染攜ts-SV40LT基因慢病毒的UC，其生長(zhǎng)曲線及細(xì)胞蛋白表達(dá)均符合tsUC的特性。
　　2、以P

7、A水凝膠為基礎(chǔ)的細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì):通過(guò)力學(xué)試驗(yàn)機(jī)的測(cè)量及篩檢，最終得到彈性模量近似于腦組織和顱腦損傷后腦組織的PA水凝膠彈性模量檢測(cè)結(jié)果，分別為0.5+0.03 kPa和8.0±0.11 kPa。按相應(yīng)比例于蓋玻片上配制出相應(yīng)彈性模量的培養(yǎng)基。
　　3、不同彈性模量水凝膠上干細(xì)胞的形態(tài)變化:相差顯微鏡下顯示，UC+NT+0.5kPa組、tsUC+MHT+0.5kPa組部分細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)長(zhǎng)的胞突，形態(tài)上類似于神經(jīng)元;而UC+NT+8.0kP

8、a組、tsUC+MHT+8.0kPa組部分細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形生長(zhǎng)，類似于肌細(xì)胞;Sham組細(xì)胞無(wú)明顯形態(tài)變化。
　　4、不同彈性模量水凝膠上干細(xì)胞的免疫熒光結(jié)果:細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示，僅UC+NT+0.5kPa組、tsUC+MHT+0.5kPa組有少量神經(jīng)元陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞，與其余3組相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*P＜0.01）;而UC+NT+0.5kPa組、tsUC+MHT+0.5kPa二者相比，神經(jīng)元分化率及神經(jīng)元軸突長(zhǎng)度均無(wú)明顯差異（

9、＃P＞0.05）。
　　5、不同腦組織提取物干預(yù)作用下干細(xì)胞的凋亡水平和細(xì)胞免疫熒光結(jié)果:與UC+Sham組相比，24 h后UC+TBI組的凋亡細(xì)胞明顯增多（*P＜0.01），而UC+TBI+MHT組可顯著逆轉(zhuǎn)TBI組誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞增多，二組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*P＜0.01）;7天后的細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示，與UC+TBI組相比，UC+TBI+MHT組UC的神經(jīng)元分化率亦明顯增高（*P＜0.01）。
　　6、大鼠腦水腫程

10、度與神經(jīng)學(xué)缺損評(píng)分:傷后第3天，TBI+tsUC+MHT組大鼠的腦組織水腫程度明顯降低，與TBI+PBS組、TBI+tsUC組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*P＜0.05，＃P＜0.05）;傷后3天，TBI+PBS組、TBI+tsUC組和TBI+tsUC+MHT組大鼠神經(jīng)學(xué)缺損評(píng)分較第1天相應(yīng)降低(aP＜0.05)，傷后7天，TBI+PBS組、TBI+tsUC組和TBI+tsUC+MHT組大鼠神經(jīng)學(xué)缺損評(píng)分較第3天相應(yīng)降低（bP＜0.05）;

11、傷后3天、7天，TBI+tsUC+MHT組大鼠的神經(jīng)學(xué)缺損評(píng)分明顯較低，與TBI+PBS組和TBI+tsUC組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（cP＜0.05，dP＜0.05）。
　　7、大鼠腦組織損傷體積測(cè)定結(jié)果:TBI+tsUC+MHT組大鼠的腦組織損傷體積明顯小于TBI+PBS組、TBI+tsUC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*P＜0.05，＃P＜0.05）。
　　8、大鼠腦組織移植細(xì)胞存活及增殖情況:免疫熒光結(jié)果顯示，TBI+ts

12、UC+MHT組移植干細(xì)胞的存活量明顯多于TBI+tsUC組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、亞低溫聯(lián)合tsUC與常溫下UC的分化能力相似，在模擬腦組織彈性模量的培養(yǎng)基中均可向神經(jīng)元分化，而在模擬TBI腦組織彈性模量的培養(yǎng)基中則無(wú)分化為神經(jīng)元的能力。
　　2、亞低溫可改善TBI腦組織的高張物理微環(huán)境，從而提高移植tsUC的存活與分化能力，并促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。
　　3、亞低溫治療可改善損傷