超氧化物增殖物受體激動劑對糖尿病腎病的治療作用及機制研究.pdf

1、糖尿病腎病(DN)是糖尿病(DM)最常見的慢性并發(fā)癥，是DM致死致殘的重要原因之一。由于生活水平的提高及生活方式的改變，DM發(fā)病率逐年提高，DN的患病人數(shù)也逐步增多。DM患者的DN發(fā)病率己達30％～50％，在西方國家，DN已占終末期腎疾病的80％。DN是DM的微血管病變之一，常見病史超過10年的患者．隨著DM患者的日益增加，DN的預防和治療成為重要的醫(yī)學課題之一。目前有許多方法用于延緩DN的進展，包括嚴格的血糖、血壓控制、使用血管緊張素

2、轉(zhuǎn)化酶抑制劑等，但是仍然有大量的DN患者進展至終末期腎病，因此急需有新的方法預防和延緩DN的進展。過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferatoractivated receptors，PPARs)是一種激素激活受體和轉(zhuǎn)錄因子。迄今，三種不同的PPAR亞型相繼克隆并分別命名為PPARα、β、δ。現(xiàn)證實PPARs的配體包括了從工業(yè)化學試劑和人工合成藥物到內(nèi)源性脂肪酸等多種結(jié)構(gòu)不同的化合物。這些配體能夠誘導大量分子

3、和細胞水平的變化，包括過氧化物酶體增殖、脂肪生成、β氧化增加和細胞周期的調(diào)節(jié)等。PPARs是調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、脂肪生成、胰島素敏感、炎癥反應(yīng)、細胞生長和分化的重要因子。 本研究第一部分旨在探討PPAR γ激動劑吡格列酮對于高糖環(huán)境下體外培養(yǎng)的腎小球系膜細胞外基質(zhì)積聚和降解的作用，以探討PPARγ對于糖尿病腎病的治療作用。 本研究第二部分擬對其藥理作用進行研究，期望能夠找到一種更理想的臨床用藥，以更好治療糖尿病及其并發(fā)癥糖尿病

4、腎病，并減輕其副作用。 研究方法： (一)第一部分:吡格列酮對糖尿病腎病腎臟纖維化的治療作用及機制探討1．細胞的培養(yǎng)及傳代腎小球系膜細胞分離純化與原代培養(yǎng)方法在文獻的基礎(chǔ)上加以改進1．1系膜細胞培養(yǎng)：每只培養(yǎng)瓶用1ml1％明膠均勻的鋪滿瓶底，放入4℃ 冰箱中過夜，備用。腎臟腫瘤手術(shù)切除后遠離病患部位的正常腎臟組織，水囊引產(chǎn)的胎兒腎，用剪刀把腎皮質(zhì)剪成碎塊，放入重疊的三層不銹鋼篩網(wǎng)，成年腎臟的篩網(wǎng)孔徑孔分別為100

5、目，150目，200目。胎兒腎篩網(wǎng)分別為100目，200目，250目。在最上層篩網(wǎng)上用研磨棒輕碾腎皮質(zhì)，同時用PBS沖洗使其濾入下層篩網(wǎng)。繼續(xù)研磨并沖洗，使其濾入下層篩網(wǎng)。沖洗第三層篩網(wǎng)，并用無菌的吸管吸取少量，將其在顯微鏡下觀察，若見去腎小囊的純凈小球達90％以上，即可將篩網(wǎng)放入無菌平皿，用PBS沖洗，收集這層篩網(wǎng)上的組織。 將收集的組織移入無菌離心管，700rpm，10min。離心后，棄上清，加入V型膠原酶，充分消化15—2

6、0min，用完全培養(yǎng)基終止消化，700rpm，10min，離心棄上清，取沉淀混勻分散后置處理好的培養(yǎng)瓶中，加入培養(yǎng)基，輕輕吹打，使沉淀在培養(yǎng)瓶中分布均勻，放入37℃，5％CO2孵箱中培養(yǎng)。 1．2系膜細胞形態(tài)學觀察：12-24小時后，腎小球即可貼壁，并且有單細胞以此為中心向外生長。第三天可將原代培養(yǎng)細胞取出觀察，用PBS沖洗，去除未貼壁的細胞、細胞碎片，并更換培養(yǎng)液。第5—6天可見卵石樣成團的細胞和梭狀單個細胞夾雜生長。7-10

7、天梭狀細胞逐漸占優(yōu)勢，卵石樣成團細胞逐漸減少。細胞長滿后，可進行傳代。 1．3免疫熒光技術(shù)鑒定：利用甲醛固定細胞后，用0．3％H202甲醇滅活內(nèi)源性過氧化氫酶，0．1％Triton x-100通透細胞，加入鼠抗人結(jié)蛋白，鼠抗人角蛋白，分別加入FITC標記單克隆抗體，溫浴后，使用熒光顯微鏡觀察并攝影，對系膜細胞進行鑒定。 1．4 MTT法觀察細胞生長狀態(tài)：第四代細胞用胰蛋白酶消化為單層培養(yǎng)細胞，含20％胎牛血清的1640培

8、養(yǎng)液配成單細胞懸液，按103-104/1接種于96孔培養(yǎng)板，細胞長滿后，加入MTT20μ1/孔，37℃繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，棄去上清，加入200μ 1SDS，孵育過夜，選擇570nm在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收值，觀察成人腎臟和胎腎培養(yǎng)系膜細胞不同的生長狀態(tài)，記錄結(jié)果。 2．葡萄糖及吡格列酮對腎小球系膜細胞PPARα、γ、σ mRNA的檢測2．1第2代細胞以1×108/l密度傳入培養(yǎng)瓶，待細胞長至80％后，更換培養(yǎng)液(16

9、40+0．5％胎牛血清)，饑餓24 h，細胞分為4組，更換相應(yīng)的培養(yǎng)基，分別為：5Mm/l D-glucose(normal glucose group，NG)，30Mm／l D-glucose(high glucose group，HG) ， 5mM／L D—glucose+25mM/lmannitol(osmotic control， mannitol group，MG)，5mM/l D-glucose+3μM/l pioglita

10、zone(pioglitazone treatment group，PIO)處理24 h(實驗中細胞均如此處理)。NG組、HG組、MG組、PIO組細胞分別培養(yǎng)24小時后。細胞用4℃的PBS(NaCL 8g；KCL 0．2g：Na2HP04 1．15g;KH2P04 0．2g，溶于1000ml蒸餾水中)洗滌1次，冰上負壓抽盡液體，每盤細胞加Trizol0．5ml，一次性無菌刮匙輕輕刮下細胞，共變換3個90度方向，以免遺漏細胞。將刮下細胞收

11、集到1．5ml EP管中，超聲30sec，加氯仿和異丙醇，提取細胞總RNA。 2．2逆轉(zhuǎn)錄(Reverse Transcription，RT)反應(yīng)。冰上操作，按TakaraRNA PCR Kit要求操作。 2．3實時定量PCR。按real-time PCR Kit要求操作。 3．葡萄糖及吡格列酮對腎小球系膜細胞Ⅳ型膠原的影響3．1 NG、HG組、MG組、PIO組腎小球系膜細胞細胞分別培養(yǎng)24小時后，7．5％變性聚

12、丙酰胺凝膠分離50μg細胞抽提總蛋白，以beta actin為蛋白對照進行定量比較。 3．2免疫熒光檢測葡萄糖及PPARγ激動劑對腎小球系膜細胞Ⅳ型膠原蛋白的影響4．PPAR γ對機制金屬蛋白酶平衡紊亂的調(diào)節(jié)作用 (二)第二部分:硝基油酸對糖尿病腎病的治療作用及機制探討 1.動物模型的構(gòu)建 1．1大鼠模型：ZDF大鼠是一種先天性糖尿病腎病模型，可以自發(fā)性的產(chǎn)生糖尿病及糖尿病腎病，一般6-8周會出現(xiàn)明顯的血

13、糖增高，12-14周會出現(xiàn)腎功能損傷，隨著年齡增長，病變不斷加重。12周ZDF大鼠分為2組，每組8只。二組大鼠在使用乙醚麻醉后，皮下埋植含硝基油酸(2μg/kg/d)微量泵。大鼠分別埋植含硝基油酸和PBS的微量泵，然后使用手術(shù)縫線縫合。微量泵共埋植28天，為防止硝基油酸部穩(wěn)定14天時更換新的微量泵，重新埋植。 微量泵埋植期間每7天采血一次，28天時，處死大鼠，同時采血，留取心臟腎臟組織。 1．2小鼠模型的構(gòu)建：

14、1．2．1 LPS模型構(gòu)建C57小鼠注射lOmg／kg致死劑量L,PS，觀察小鼠生存率變化 1．2．2盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(cecal ligation and puncture)C57小鼠使用乙醚麻醉后，皮下埋植含硝基油酸(200μg/kg/d)的微量泵。48h后打開腹腔，在盲腸末端1厘米處截扎，用20號針頭在腸壁兩端各扎一眼，擠出5毫米糞便，關(guān)閉腹腔。6小時后注射抗生素，后每12小時注射一次。24小時后處死動物，采集血液及肝臟腎臟

15、組織。 2.血液、尿液及組織標本的采集2．1 ZDF大鼠血液及組織標本的采集：ZDF大鼠皮下埋植含硝基油酸的微量泵后每周自尾靜脈采血1次，采血前一晚禁食，血液在采集2-3分鐘內(nèi)進行離心，分離紅細胞和血清。4周處死大鼠。處死前，使用乙醚麻醉，自下腔靜脈采血，然后處死。留取心臟和腎臟組織，組織放入液氮中保存。 2．2尿液標本采集：ZDF大鼠放入代謝籠中，收集24小時尿。收集的尿液在低溫離心機中以8000rpm離心5分鐘，吸取

16、上清，放入低溫冰箱保存。 3．RNA的提取和Real-time PCR 4．蛋白的提取和Weatern blot 5．血液檢測：全血分離血漿后，監(jiān)測血糖、膽固醇、甘油三酯、尿素氮、肌酐等糖尿病腎病相關(guān)指標，檢測TNF-α等炎癥指標，并作胰島素的監(jiān)測和糖耐量檢查 5．1胰島素的監(jiān)測：采用Crystal chem公司大鼠超敏胰島素試劑盒檢測 5．2糖耐量檢查：禁食4小時后，使用20％葡萄糖灌胃，分別于

17、0、15、30、60、90分鐘后采血，監(jiān)測血糖和胰島素水平。 6．尿液檢查：尿液檢測尿蛋白、一氧化氮。 7．HE染色 結(jié)論： 1．我們的研究表明，高糖能抑制PPAR γ基因、蛋白表達，刺激Ⅳ型膠原產(chǎn)生，使腎小球系膜細胞金屬機制蛋白酶系統(tǒng)發(fā)生紊亂，使用PPARγ激動劑吡格列酮處理可以改善上述情況，提示PPARγ可以通過調(diào)節(jié)金屬機制蛋白酶系統(tǒng)來調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)的降解，從而對糖尿病時腎小球系膜細胞細胞外基質(zhì)蓄積產(chǎn)