超氧化物增殖物受體激動(dòng)劑對(duì)糖尿病腎病的治療作用及機(jī)制研究.pdf

1、糖尿病腎病(DN)是糖尿病(DM)最常見的慢性并發(fā)癥，是DM致死致殘的重要原因之一。由于生活水平的提高及生活方式的改變，DM發(fā)病率逐年提高，DN的患病人數(shù)也逐步增多。DM患者的DN發(fā)病率己達(dá)30％～50％，在西方國(guó)家，DN已占終末期腎疾病的80％。DN是DM的微血管病變之一，常見病史超過(guò)10年的患者．隨著DM患者的日益增加，DN的預(yù)防和治療成為重要的醫(yī)學(xué)課題之一。目前有許多方法用于延緩DN的進(jìn)展，包括嚴(yán)格的血糖、血壓控制、使用血管緊張素

2、轉(zhuǎn)化酶抑制劑等，但是仍然有大量的DN患者進(jìn)展至終末期腎病，因此急需有新的方法預(yù)防和延緩DN的進(jìn)展。過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferatoractivated receptors，PPARs)是一種激素激活受體和轉(zhuǎn)錄因子。迄今，三種不同的PPAR亞型相繼克隆并分別命名為PPARα、β、δ?，F(xiàn)證實(shí)PPARs的配體包括了從工業(yè)化學(xué)試劑和人工合成藥物到內(nèi)源性脂肪酸等多種結(jié)構(gòu)不同的化合物。這些配體能夠誘導(dǎo)大量分子

3、和細(xì)胞水平的變化，包括過(guò)氧化物酶體增殖、脂肪生成、β氧化增加和細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)等。PPARs是調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、脂肪生成、胰島素敏感、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的重要因子。 本研究第一部分旨在探討PPAR γ激動(dòng)劑吡格列酮對(duì)于高糖環(huán)境下體外培養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)胞外基質(zhì)積聚和降解的作用，以探討PPARγ對(duì)于糖尿病腎病的治療作用。 本研究第二部分?jǐn)M對(duì)其藥理作用進(jìn)行研究，期望能夠找到一種更理想的臨床用藥，以更好治療糖尿病及其并發(fā)癥糖尿病

4、腎病，并減輕其副作用。 研究方法： (一)第一部分:吡格列酮對(duì)糖尿病腎病腎臟纖維化的治療作用及機(jī)制探討1．細(xì)胞的培養(yǎng)及傳代腎小球系膜細(xì)胞分離純化與原代培養(yǎng)方法在文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)1．1系膜細(xì)胞培養(yǎng)：每只培養(yǎng)瓶用1ml1％明膠均勻的鋪滿瓶底，放入4℃ 冰箱中過(guò)夜，備用。腎臟腫瘤手術(shù)切除后遠(yuǎn)離病患部位的正常腎臟組織，水囊引產(chǎn)的胎兒腎，用剪刀把腎皮質(zhì)剪成碎塊，放入重疊的三層不銹鋼篩網(wǎng)，成年腎臟的篩網(wǎng)孔徑孔分別為100

5、目，150目，200目。胎兒腎篩網(wǎng)分別為100目，200目，250目。在最上層篩網(wǎng)上用研磨棒輕碾腎皮質(zhì)，同時(shí)用PBS沖洗使其濾入下層篩網(wǎng)。繼續(xù)研磨并沖洗，使其濾入下層篩網(wǎng)。沖洗第三層篩網(wǎng)，并用無(wú)菌的吸管吸取少量，將其在顯微鏡下觀察，若見去腎小囊的純凈小球達(dá)90％以上，即可將篩網(wǎng)放入無(wú)菌平皿，用PBS沖洗，收集這層篩網(wǎng)上的組織。 將收集的組織移入無(wú)菌離心管，700rpm，10min。離心后，棄上清，加入V型膠原酶，充分消化15—2

6、0min，用完全培養(yǎng)基終止消化，700rpm，10min，離心棄上清，取沉淀混勻分散后置處理好的培養(yǎng)瓶中，加入培養(yǎng)基，輕輕吹打，使沉淀在培養(yǎng)瓶中分布均勻，放入37℃，5％CO2孵箱中培養(yǎng)。 1．2系膜細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：12-24小時(shí)后，腎小球即可貼壁，并且有單細(xì)胞以此為中心向外生長(zhǎng)。第三天可將原代培養(yǎng)細(xì)胞取出觀察，用PBS沖洗，去除未貼壁的細(xì)胞、細(xì)胞碎片，并更換培養(yǎng)液。第5—6天可見卵石樣成團(tuán)的細(xì)胞和梭狀單個(gè)細(xì)胞夾雜生長(zhǎng)。7-10

7、天梭狀細(xì)胞逐漸占優(yōu)勢(shì)，卵石樣成團(tuán)細(xì)胞逐漸減少。細(xì)胞長(zhǎng)滿后，可進(jìn)行傳代。 1．3免疫熒光技術(shù)鑒定：利用甲醛固定細(xì)胞后，用0．3％H202甲醇滅活內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶，0．1％Triton x-100通透細(xì)胞，加入鼠抗人結(jié)蛋白，鼠抗人角蛋白，分別加入FITC標(biāo)記單克隆抗體，溫浴后，使用熒光顯微鏡觀察并攝影，對(duì)系膜細(xì)胞進(jìn)行鑒定。 1．4 MTT法觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)：第四代細(xì)胞用胰蛋白酶消化為單層培養(yǎng)細(xì)胞，含20％胎牛血清的1640培

8、養(yǎng)液配成單細(xì)胞懸液，按103-104/1接種于96孔培養(yǎng)板，細(xì)胞長(zhǎng)滿后，加入MTT20μ1/孔，37℃繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，棄去上清，加入200μ 1SDS，孵育過(guò)夜，選擇570nm在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值，觀察成人腎臟和胎腎培養(yǎng)系膜細(xì)胞不同的生長(zhǎng)狀態(tài)，記錄結(jié)果。 2．葡萄糖及吡格列酮對(duì)腎小球系膜細(xì)胞PPARα、γ、σ mRNA的檢測(cè)2．1第2代細(xì)胞以1×108/l密度傳入培養(yǎng)瓶，待細(xì)胞長(zhǎng)至80％后，更換培養(yǎng)液(16

9、40+0．5％胎牛血清)，饑餓24 h，細(xì)胞分為4組，更換相應(yīng)的培養(yǎng)基，分別為：5Mm/l D-glucose(normal glucose group，NG)，30Mm／l D-glucose(high glucose group，HG) ， 5mM／L D—glucose+25mM/lmannitol(osmotic control， mannitol group，MG)，5mM/l D-glucose+3μM/l pioglita

10、zone(pioglitazone treatment group，PIO)處理24 h(實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞均如此處理)。NG組、HG組、MG組、PIO組細(xì)胞分別培養(yǎng)24小時(shí)后。細(xì)胞用4℃的PBS(NaCL 8g；KCL 0．2g：Na2HP04 1．15g;KH2P04 0．2g，溶于1000ml蒸餾水中)洗滌1次，冰上負(fù)壓抽盡液體，每盤細(xì)胞加Trizol0．5ml，一次性無(wú)菌刮匙輕輕刮下細(xì)胞，共變換3個(gè)90度方向，以免遺漏細(xì)胞。將刮下細(xì)胞收

11、集到1．5ml EP管中，超聲30sec，加氯仿和異丙醇，提取細(xì)胞總RNA。 2．2逆轉(zhuǎn)錄(Reverse Transcription，RT)反應(yīng)。冰上操作，按TakaraRNA PCR Kit要求操作。 2．3實(shí)時(shí)定量PCR。按real-time PCR Kit要求操作。 3．葡萄糖及吡格列酮對(duì)腎小球系膜細(xì)胞Ⅳ型膠原的影響3．1 NG、HG組、MG組、PIO組腎小球系膜細(xì)胞細(xì)胞分別培養(yǎng)24小時(shí)后，7．5％變性聚

12、丙酰胺凝膠分離50μg細(xì)胞抽提總蛋白，以beta actin為蛋白對(duì)照進(jìn)行定量比較。 3．2免疫熒光檢測(cè)葡萄糖及PPARγ激動(dòng)劑對(duì)腎小球系膜細(xì)胞Ⅳ型膠原蛋白的影響4．PPAR γ對(duì)機(jī)制金屬蛋白酶平衡紊亂的調(diào)節(jié)作用 (二)第二部分:硝基油酸對(duì)糖尿病腎病的治療作用及機(jī)制探討 1.動(dòng)物模型的構(gòu)建 1．1大鼠模型：ZDF大鼠是一種先天性糖尿病腎病模型，可以自發(fā)性的產(chǎn)生糖尿病及糖尿病腎病，一般6-8周會(huì)出現(xiàn)明顯的血

13、糖增高，12-14周會(huì)出現(xiàn)腎功能損傷，隨著年齡增長(zhǎng)，病變不斷加重。12周ZDF大鼠分為2組，每組8只。二組大鼠在使用乙醚麻醉后，皮下埋植含硝基油酸(2μg/kg/d)微量泵。大鼠分別埋植含硝基油酸和PBS的微量泵，然后使用手術(shù)縫線縫合。微量泵共埋植28天，為防止硝基油酸部穩(wěn)定14天時(shí)更換新的微量泵，重新埋植。 微量泵埋植期間每7天采血一次，28天時(shí)，處死大鼠，同時(shí)采血，留取心臟腎臟組織。 1．2小鼠模型的構(gòu)建：

14、1．2．1 LPS模型構(gòu)建C57小鼠注射lOmg／kg致死劑量L,PS，觀察小鼠生存率變化 1．2．2盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(cecal ligation and puncture)C57小鼠使用乙醚麻醉后，皮下埋植含硝基油酸(200μg/kg/d)的微量泵。48h后打開腹腔，在盲腸末端1厘米處截扎，用20號(hào)針頭在腸壁兩端各扎一眼，擠出5毫米糞便，關(guān)閉腹腔。6小時(shí)后注射抗生素，后每12小時(shí)注射一次。24小時(shí)后處死動(dòng)物，采集血液及肝臟腎臟

15、組織。 2.血液、尿液及組織標(biāo)本的采集2．1 ZDF大鼠血液及組織標(biāo)本的采集：ZDF大鼠皮下埋植含硝基油酸的微量泵后每周自尾靜脈采血1次，采血前一晚禁食，血液在采集2-3分鐘內(nèi)進(jìn)行離心，分離紅細(xì)胞和血清。4周處死大鼠。處死前，使用乙醚麻醉，自下腔靜脈采血，然后處死。留取心臟和腎臟組織，組織放入液氮中保存。 2．2尿液標(biāo)本采集：ZDF大鼠放入代謝籠中，收集24小時(shí)尿。收集的尿液在低溫離心機(jī)中以8000rpm離心5分鐘，吸取

16、上清，放入低溫冰箱保存。 3．RNA的提取和Real-time PCR 4．蛋白的提取和Weatern blot 5．血液檢測(cè)：全血分離血漿后，監(jiān)測(cè)血糖、膽固醇、甘油三酯、尿素氮、肌酐等糖尿病腎病相關(guān)指標(biāo)，檢測(cè)TNF-α等炎癥指標(biāo)，并作胰島素的監(jiān)測(cè)和糖耐量檢查 5．1胰島素的監(jiān)測(cè)：采用Crystal chem公司大鼠超敏胰島素試劑盒檢測(cè) 5．2糖耐量檢查：禁食4小時(shí)后，使用20％葡萄糖灌胃，分別于

17、0、15、30、60、90分鐘后采血，監(jiān)測(cè)血糖和胰島素水平。 6．尿液檢查：尿液檢測(cè)尿蛋白、一氧化氮。 7．HE染色 結(jié)論： 1．我們的研究表明，高糖能抑制PPAR γ基因、蛋白表達(dá)，刺激Ⅳ型膠原產(chǎn)生，使腎小球系膜細(xì)胞金屬機(jī)制蛋白酶系統(tǒng)發(fā)生紊亂，使用PPARγ激動(dòng)劑吡格列酮處理可以改善上述情況，提示PPARγ可以通過(guò)調(diào)節(jié)金屬機(jī)制蛋白酶系統(tǒng)來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而對(duì)糖尿病時(shí)腎小球系膜細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)蓄積產(chǎn)