家蠶表達(dá)的綠色熒光蛋白標(biāo)記的霍亂毒素B亞基與人胰島素融合蛋白抗1型糖尿病的研究.pdf

1、1型糖尿病(type1 diabetes，T1D)是一種針對(duì)胰腺胰島β細(xì)胞的自身免疫性疫病，其結(jié)果是導(dǎo)致胰島素分泌缺乏。自身反應(yīng)性抗體和T淋巴細(xì)胞的出現(xiàn)、T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病過繼轉(zhuǎn)移性以及對(duì)免疫抑制治療的敏感性是T1D自身免疫性的集中表現(xiàn)。在該疾病的發(fā)生過程中，胰島素(insulin，Ins)、胰島素其前體、谷氨酸脫羧酶等是其主要自身抗原。
　　 1口服家蠶表達(dá)的綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GF

2、P)標(biāo)記的霍亂毒素B亞基(cholera toxin B subunit，CTB)與人胰島素融合蛋白治療1型糖尿病的研究
　　 口服一種疾病特異的自身抗原可誘導(dǎo)機(jī)體對(duì)該疾病產(chǎn)生免疫反應(yīng)的耐受，從而抑制或延緩該自身免疫性疾病的發(fā)展。在機(jī)體內(nèi)有效誘導(dǎo)免疫耐受需要長期的口服大劑量的特異蛋白抗原，而CTB是誘導(dǎo)口服免疫耐受的強(qiáng)有力的粘膜佐劑分子，可開發(fā)用來偶聯(lián)抗原蛋白大大減少抗原蛋白的口服耐受誘導(dǎo)使用劑量，提示CTB偶聯(lián)自身抗原Ins誘

3、導(dǎo)口服耐受防治T1D可能具有實(shí)際的治療意義和潛在的應(yīng)用前景。
　　 在本研究中我們構(gòu)建了GFP標(biāo)記的CTB與人Ins融合基因，并利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在家蠶中高效表達(dá)該蛋白，該融合蛋白(48kDa)在家蠶幼蟲的血淋巴中表達(dá)量達(dá)到0.58mg/ml。經(jīng)驗(yàn)證，該融合蛋白在家蠶中以五聚體形式存在，并且保持與神經(jīng)節(jié)苷脂GM1的結(jié)合特性以及CTB和Ins的抗原性。非肥胖性糖尿病(non-obese diabetes，NO

4、D)小鼠口服微克級(jí)的含此融合蛋白的蠶血淋巴，胰腺的組織病理切片顯示胰島發(fā)炎程度顯著減輕，適時(shí)監(jiān)測(cè)血糖的實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦表明T1D的發(fā)病明顯延緩。這些結(jié)果表明家蠶生物反應(yīng)器是一個(gè)理想的口服疫苗生產(chǎn)體系，并且口服通過該生產(chǎn)體系表達(dá)的蛋白可誘導(dǎo)對(duì)T細(xì)胞介導(dǎo)的某些自身免疫疾病的耐受，在該方向上的科學(xué)研究利用我國自身蠶業(yè)資源的優(yōu)勢(shì)探索T1D的口服治療疫苗，為T1D的治療提供了新的切入點(diǎn)。
　　 2.口服胰島素治療T1D的作用機(jī)制與特異性調(diào)節(jié)性T

5、(regulatory T，Treg)細(xì)胞的相關(guān)性研究
　　 粘膜誘導(dǎo)的免疫耐受在治療自身免疫性疾病中極具發(fā)展前景。文獻(xiàn)報(bào)道，通過鼻腔粘膜，舌下腺或小腸粘膜誘導(dǎo)的特異性耐受與Treg細(xì)胞有關(guān)，尤其在小腸內(nèi)抗原蛋白經(jīng)由樹突狀細(xì)胞提呈給免疫細(xì)胞，可能誘導(dǎo)出適合Treg產(chǎn)生的環(huán)境，通過抗原特異性Treg細(xì)胞的誘導(dǎo)發(fā)揮免疫抑制作用，相類似的作用在腫瘤浸潤過程中也得到證實(shí)。
　　 在本實(shí)驗(yàn)研究中，我們構(gòu)建的GFP標(biāo)記的CTB與人I

6、ns融合蛋白與本實(shí)驗(yàn)室已有的CTB-INS融合蛋白均可誘導(dǎo)Ins特異的口服耐受。利用GFP標(biāo)簽我們追蹤到融合蛋白可與小腸粘膜發(fā)生特異性結(jié)合。在小鼠血液中，我們檢測(cè)到抗CTB、Ins的特異抗體亞型IgG1抗體水平升高，同時(shí)脾臟、小腸淋巴結(jié)、血液中CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞與對(duì)照組相比顯著增加。而脾臟淋巴細(xì)胞的增值和遷移能力受到抑制提示此融合蛋白誘導(dǎo)的口服耐受與特異性Treg的產(chǎn)生相關(guān)。NOD/SCID小鼠過繼轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)表明口服耐受