基于免疫親和原理的循環(huán)腫瘤細(xì)胞富集-篩選芯片的構(gòu)建及應(yīng)用初探.pdf

1、循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTCs)是脫離原發(fā)病灶，侵襲并進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)的癌細(xì)胞，可以作為診斷患者預(yù)后或腫瘤復(fù)發(fā)、揭示腫瘤轉(zhuǎn)移行為、合理指導(dǎo)臨床個(gè)體化治療的指標(biāo)，是目前腫瘤學(xué)的研究熱點(diǎn)。采用基于免疫親和原理的微流控芯片系統(tǒng)對CTCs進(jìn)行檢測，具有高檢出率、高敏感度、高特異性、低消耗量、操作簡單、可集成化和自動(dòng)化的優(yōu)勢，在臨床的腫瘤轉(zhuǎn)移監(jiān)控、化療和放射效果的評估及預(yù)后評估、轉(zhuǎn)移初期發(fā)現(xiàn)并控制腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散及

2、制定治療方案等方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。本論文通過采用聚二甲基硅氧烷(PDMS)模塑固化、清洗、打孔、封接、改性和界面功能化等步驟構(gòu)建了基于免疫親和原理的微流控芯片，通過探討芯片構(gòu)型、封接方法、表面改性和功能化界面的構(gòu)建，建立了免疫親和原理的CTCs富集/篩選芯片，并對實(shí)驗(yàn)條件參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，初步評價(jià)芯片在血液樣本中的應(yīng)用。
　　 1)提出微壩型、逶迤型和人字形脊三種芯片構(gòu)型，采用ANSYS軟件和CFX軟件進(jìn)行和分析，確定了芯片的尺

3、寸和實(shí)驗(yàn)參數(shù)。
　　 2)確定了芯片的制作、封接和驅(qū)動(dòng)方式。采用PDMS材料以模塑法在硅模板或SU-8模板上制作芯片，全PDMS芯片通過等離子體處理封接，封接時(shí)間為60s，電壓設(shè)置為800V，通入空氣的氣體體積流量為200ml/min，此方法下，芯片封接牢固，無開裂和漏液。并考察了正壓驅(qū)動(dòng)和負(fù)壓驅(qū)動(dòng)兩種方式下的流體流動(dòng)，選擇負(fù)壓驅(qū)動(dòng)方式可減少進(jìn)樣管路中的靶細(xì)胞損失。
　　 3)篩選了芯片改性的硅烷化試劑?？疾炝斯柰榛噭?/p>

4、氨丙基三乙氧基硅烷(aminopropyltriethoxysilane，APTES)和γ-(2，3-環(huán)氧丙氧基)丙基三甲氧基硅烷(3-glycidoxypropyltrimethoxysilane，GPTMS)對PDMS的改性效果，以接觸角實(shí)驗(yàn)表征不同硅烷化試劑處理的PDMS樣本親水性，篩選硅烷化試劑及其濃度，并以芯片上的非特異性細(xì)胞捕獲實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證篩選結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，兩種硅烷化試劑均對PDMS表面具有改性作用，其中在體積濃度為2％G

5、PTMS處理后的芯片表面測得的接觸角值最小，芯片對細(xì)胞非特異性吸附為5.3％，固載抗體后芯片對細(xì)胞的凈捕獲率為53.96％。
　　 4)采用五種不同抗體連接方法構(gòu)建功能化界面，并對芯片效能和抗體活性進(jìn)行評價(jià)，篩選出最優(yōu)的PDMS芯片構(gòu)建方法為：等離子體處理封接-體積濃度2％GPTMS硅烷化處理-接枝PEI-戊二醛(glutaraldehyde，GA)引發(fā)固載抗體。以X衍射光電子能譜(XPS)、衰減全反射傅里葉紅外光譜(ATR-F