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文檔簡介
1、研究目的:
證明USF2是泛素連接酶Smurf1和Smurf2的負(fù)性轉(zhuǎn)錄因子,對Smurf1/2在轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平上有抑制作用,并對其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討,更進(jìn)一步研究USF2對Smurf1/2的發(fā)揮抑制作用的功能區(qū)域。
研究方法:
一.USF2與其截短體真核表達(dá)載體的構(gòu)建
1.Myc-USF2與其截短體Myc-USF2(1-235aa)、Myc-USF2(236-346aa)的
2、構(gòu)建根據(jù)USF2基因序列設(shè)計PCR引物,提取細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄后得到cDNA文庫。再以cDNA為模板,分別取USF2、USF2(1-235aa)、USF2(236-346aa)上下游引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到目的基因片段。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳分離、回收、酶切后,插入pCMV-Myc的多克隆位點(diǎn)Kpn(Ⅰ)和Sal(Ⅰ)之間。連接產(chǎn)物經(jīng)E.coliDH5α菌株轉(zhuǎn)化后,挑取單克隆并提取質(zhì)粒,經(jīng)限制性雙酶切鑒定后,陽性克隆送測序測序,測序正確的即為
3、Myc-USF2、USF2(1-235aa)、USF2(236-346aa)。
2.轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞驗證重組質(zhì)粒的表達(dá)
各重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞48小時后,收取細(xì)胞,制作蛋白樣品,后經(jīng)由Westernblot驗證其在真核細(xì)胞中的正確表達(dá)。
二.USF2對Smurf1、Smurt2的功能調(diào)控研究
1.Smurf1/2對USF2的調(diào)控作用
梯度轉(zhuǎn)染Flag-Smurf1或Flag-
4、Smurf2,48小時后,收取并裂解細(xì)胞,制作蛋白樣品,經(jīng)Westernblot驗證其在細(xì)胞中對USF2的調(diào)控作用。內(nèi)源性免疫共沉淀(Co-IP)實(shí)驗驗證Smurfs和USF2是否存在相互作用,實(shí)驗組使用USF2抗體進(jìn)行IP,對照組使用小鼠NormalIgG抗體,Smurf1抗體和Smurf2抗體檢測IP樣品,以此判斷USF2與Smurf1或Smurf2之間有無相互作用。
2.USF2抑制Smurf1/2的轉(zhuǎn)錄表達(dá)
5、 梯度過表達(dá)Myc-USF2,Westernblot檢測Smurf1/2的蛋白水平的變化,再利用實(shí)時定量PCR技術(shù)檢測Smurf1/2的mRNA水平,檢測USF2對Smurf1/2蛋白及轉(zhuǎn)錄水平的影響。為了進(jìn)一步驗證USF2對Smurf1/2的調(diào)節(jié)作用,細(xì)胞中依次轉(zhuǎn)染USF2siRNA及ControlsiRNA,敲低細(xì)胞內(nèi)源USF2,再分別利用Westernblot和實(shí)時定量PCR技術(shù)檢測Smurf1/2蛋白水平和轉(zhuǎn)錄水平的變化。
6、利用生物信息學(xué)段分析Smurf1/2的啟動子區(qū)是否含有E-box結(jié)構(gòu)域,之后構(gòu)建了含有Smurf1/2promoter區(qū)E-box結(jié)構(gòu)域的PGL3-enhance報告基因載體,通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒瀬眚炞CUSF2對Smurf1/2啟動子活性的抑制作用。
3.USF2結(jié)合Smurf1/2啟動子區(qū)
本實(shí)驗設(shè)計體內(nèi)、體外實(shí)驗,來確認(rèn)USF2可以結(jié)合Smurf1/2啟動子區(qū),進(jìn)一步證實(shí)USF2是Smurf1/2的
7、轉(zhuǎn)錄抑制因子。首先設(shè)計引物,進(jìn)行體內(nèi)染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)實(shí)驗,從而證實(shí)在體內(nèi)USF2可以結(jié)合Smurf1/2啟動子區(qū)。為了確證USF2在體外可以直接結(jié)合Smurf1/2啟動子區(qū),我們首先純化GST-USF2蛋白,并驗證其正確表達(dá),然后制作包含Smurf1/2E-box結(jié)構(gòu)域的生物素標(biāo)記探針,進(jìn)行體外凝膠遷移(EMSA)實(shí)驗。其中,為了進(jìn)一步確認(rèn)結(jié)果的可靠性和確認(rèn)USF2和Smurf1/2promoter區(qū)結(jié)合的特異性,我們設(shè)計了冷
8、探針競爭實(shí)驗,即使用不同高濃度的未標(biāo)記生物素的冷探針和突變冷探針,競爭生物素探針與USF2蛋白的結(jié)合。另外我們使用USF2抗體,進(jìn)行超阻滯實(shí)驗,以排除其他基因或非特異性蛋白帶來的影響。
三.USF2對Smur1/2發(fā)揮抑制效應(yīng)功能區(qū)的研究
將Myc-USF2、Myc-USF2(1-235aa)、Myc-USF2(236-346aa)轉(zhuǎn)染到MCF7細(xì)胞中,48h后收集并裂解細(xì)胞,通過Westernblot及實(shí)時
9、定量PCR確定USF2抑制Smurf1/2轉(zhuǎn)錄水平的具體功能區(qū)域。
研究結(jié)果:
一.USF2與其截短體真核表達(dá)載體的構(gòu)建
1.成功構(gòu)建重組質(zhì)粒Myc-USF2、USF2(1-235aa)、USF2(236-346aa)。
挑取陽性克隆,提取質(zhì)粒后進(jìn)行雙酶切鑒定,將酶切陽性結(jié)果送測序,測序正確的重組質(zhì)粒說明Myc-USF2、USF2(1-235aa)、USF2(236-346aa)構(gòu)
10、建成功。
2.轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞重組質(zhì)粒的正確表達(dá)
將構(gòu)建正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞,經(jīng)Westernblot驗證其在真核細(xì)胞中能夠正確表達(dá)。
二.USF2對Smurf1、Smurf2的功能調(diào)控研究
1.Smurf1/2對USF2無調(diào)控作用
梯度轉(zhuǎn)染Flag-Smurf1或Flag-Smurf2,由Westernblot驗證,發(fā)現(xiàn)USF2蛋白水平不隨著Smurf1/2的變化而變
11、化,初步認(rèn)為USF2不是Smurf1/2的泛素化底物。而后進(jìn)行的內(nèi)源性Co-IP實(shí)驗證明,和使用NormalIgG抗體的對照組一樣,使用USF2抗體進(jìn)行IP的實(shí)驗組沒有檢測到Smurf1或Smurf2,說明USF2與Smurfs之間無相互作用。
2.USF2對Smurf1/2轉(zhuǎn)錄有抑制作用
梯度轉(zhuǎn)染Myc-USF2,Westernblot檢測后發(fā)現(xiàn)Smurf1/2的蛋白水平呈現(xiàn)梯度下降,實(shí)時定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)
12、Smurf1/2的mRNA水平也下降,說明USF2對Smurfs的蛋白水平和mRNA水平均有抑制作用。敲低細(xì)胞內(nèi)源USF2后則得到相反的效應(yīng)。為了確證USF2對Smurfs是在轉(zhuǎn)錄水平還是轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮抑制作用,我們構(gòu)建了含有Smurf1/2promoter區(qū)E-box結(jié)構(gòu)域的PGL3-enhance報告基因,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)USF2對Smurf1/2轉(zhuǎn)錄活性具有明顯的抑制作用,敲低反之。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實(shí)USF2對Smurf1/2是
13、在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)揮了抑制作用而最終導(dǎo)致其大蛋白水平的降低。
3.USF2結(jié)合Smurf1/2啟動子區(qū)
ChIP實(shí)驗明確USF2在體內(nèi)可以結(jié)合Smurf1/2的啟動子,證實(shí)USF2是Smurf1/2的轉(zhuǎn)錄因子。純化GST-USF2蛋白,Westernblot并驗證其正確表達(dá)。進(jìn)行體外EMSA實(shí)驗,結(jié)果得到USF2和Smurf1/2promoter區(qū)結(jié)合能夠產(chǎn)生DNA-蛋白復(fù)合體,即說明USF2在體外可以直接結(jié)合Sm
14、urf1/2的啟動子。使用不同高濃度的冷探針,可以成功競爭生物素探針與USF2蛋白的結(jié)合;而使用突變探針后,DNA-蛋白復(fù)合體結(jié)合條帶消失,從而進(jìn)一步確證USF2特異的結(jié)合Smurf1/2的啟動子。另外,使用USF2抗體進(jìn)行EMSA超阻滯實(shí),發(fā)現(xiàn)結(jié)合條帶遷移明顯滯后。以上說明USF2特異性結(jié)合Smurf1/2啟動子區(qū)。
三.USF2對Smur1/2發(fā)揮抑制效應(yīng)功能區(qū)的研究
轉(zhuǎn)染Myc-USF2、Myc-USF
15、2(1-235aa)、Myc-USF2(236-346aa)48h后,Westernblot及實(shí)時定量PCR,發(fā)現(xiàn)Myc-USF2、Myc-USF2(236-346aa)對Smurf1/2的蛋白及轉(zhuǎn)錄水平有抑制作用,而Myc-USF2(1-235aa)不具備抑制效應(yīng),說明對Smurf1/2發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制的功能區(qū)域主要是USF2的第236到第346氨基酸之間的區(qū)域。
結(jié)論及意義:
本研究首次發(fā)現(xiàn)了Smurf1和S
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