Prx2、Foxo3a、Nrf2在腦梗死大鼠腦組織的表達(dá)及普羅布考和阿托伐他汀聯(lián)合應(yīng)用的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制的研究.pdf

1、目的:腦血管病已成為我國居民死亡的第一原因和成人殘疾的第一原因,以缺血性腦血管病最為常見。腦梗死后最初幾天的繼發(fā)性腦損傷常導(dǎo)致病情加重,主要包括氧化應(yīng)激、細(xì)胞炎癥反應(yīng)、Ca2+穩(wěn)態(tài)失調(diào)、細(xì)胞毒性作用、活性氧及自由基等,這是一個(gè)復(fù)雜的病理級(jí)聯(lián)反應(yīng),其中過度炎癥免疫反應(yīng)和氧化應(yīng)激存在于腦梗死后壞死和缺血區(qū)域,成為導(dǎo)致繼發(fā)損傷的主要原因。因此,如何減輕炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷成為治療急性腦梗死的重要方法。然而,抗炎和抗氧化應(yīng)激聯(lián)合治療在缺血性腦

2、血管病的臨床研究中還未能取得較好的效果。聯(lián)合應(yīng)用抗炎和抗氧化的藥物可能為腦梗死的治療帶來新的突破。阿托伐他汀(atorvastatin)和普羅布考(probucol)是臨床常用的調(diào)脂藥物,除了能調(diào)節(jié)血脂外,大量的藥理和臨床研究已證實(shí)其分別具有較好的抗炎和抗氧化作用,但其聯(lián)合應(yīng)用是否會(huì)有協(xié)同作用及可能的機(jī)制尚不完全明確。
　　 Peroxiredoxin2(Prx2)在細(xì)胞內(nèi)主要起抗過氧化和調(diào)節(jié)H2O2介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用以及細(xì)胞內(nèi)

3、抗活性氧(ROS)的防御作用。Foxo3a是Foxo轉(zhuǎn)錄因子中的一員,在細(xì)胞代謝中發(fā)揮著廣泛的作用,如通過清除ROS、調(diào)節(jié)抗氧化酶發(fā)揮強(qiáng)大的抗氧化作用,以及延長壽命,糖代謝等。Nrf2可誘導(dǎo)多種抗氧化酶及Ⅱ相解毒酶的協(xié)同表達(dá),清除細(xì)胞內(nèi)ROS從而發(fā)揮較強(qiáng)的抗氧化作用。Prx2,Foxo3a及Nrf2參與缺血后腦損傷的病理生理過程,在缺血性腦血管病引起的神經(jīng)細(xì)胞損傷中起著重要的作用。
　　 本實(shí)驗(yàn)在大鼠永久性大腦中動(dòng)脈阻塞(mid

4、dle cerebral artery occlusion,MCAO)所致的腦缺血模型上觀察腦缺血后Prx2,Foxo3a的動(dòng)態(tài)表達(dá)規(guī)律,以及阿托伐他汀和普羅布考聯(lián)合應(yīng)用在腦缺血損傷中的神經(jīng)保護(hù)作用及其對(duì)Prx2,Foxo3a及Nrf2的影響。
　　 方法:采用成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠,應(yīng)用改良Longa線栓法建立大鼠右側(cè)MCAO模型。實(shí)驗(yàn)一:觀察腦缺血后不同時(shí)間點(diǎn)Prx2和Foxo3a的動(dòng)態(tài)表達(dá);實(shí)驗(yàn)分為正

5、常對(duì)照組、缺血后3 h、6 h、12 h、24h、48 h、72 h六個(gè)時(shí)間點(diǎn)組。實(shí)驗(yàn)二:測定腦梗塞后普羅布考和阿托伐他汀的神經(jīng)保護(hù)作用。隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham)、MCAO組、普羅布考組(MCAO+probucol150 mg/kg,P)、阿托伐他汀和普羅布考聯(lián)合組(MCAO+atorvastatin(10 mg/kg))+probucol(150 mg/kg),A+P)、阿托伐他汀組(MCAO+atorvastatin10 mg/

6、kg,A)。給藥組動(dòng)物梗死后根據(jù)不同的組別立即腹腔注射相應(yīng)藥物,MCAO組和Sham組立即給予等容積生理鹽水。術(shù)后24 h和72 h對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。評(píng)分完畢將動(dòng)物斷頭處死,用干濕重法測定腦組織含水量,用2％2,3,5-三苯基四唑氮紅(triphenyltetrazolium chloride,TTC)染色法測算腦梗死體積,用免疫組化、Western Blot和逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(Reverse Transcription-Pol

7、ymeraseChain Reaction,RT-PCR)來觀察Prx2,Foxo3a,Nrf2的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)三:觀察腦缺血后阿托伐他汀和普羅布考對(duì)血腦屏障的影響。應(yīng)用激光共聚焦技術(shù)觀察干預(yù)前后腦血管外IgG含量變化,Western blot檢測干預(yù)前后血腦屏障緊密連接蛋白claudin-5的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1腦缺血3 h后Prx2,Foxo3a表達(dá)開始降低,在蛋白水平于24 h達(dá)低谷,48h逐漸升高;在m

8、RNA水平于48小時(shí)達(dá)低谷,72小時(shí)逐漸升高。
　　 2 MCAO組、普羅布考組、普羅布考和阿托伐他汀聯(lián)合組、阿托伐他汀組大鼠均出現(xiàn)不同程度的左側(cè)肢體偏癱。聯(lián)合用藥組的神經(jīng)功能評(píng)分低于MCAO組,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(A+P vs.MCAO:2.70±0.68 vs.3.40±0.70,P＞0.05)。普羅布考組和阿托伐他汀組與MCAO組相比,神經(jīng)功能評(píng)分無明顯差異(P vs.MCAO:3.10±0.74 vs.3.40±0.70

9、,P＞0.05;A vs.MCAO:3.2±0.63 vs.3.40±0.70,P＞0.05)。
　　 3普羅布考組、聯(lián)合用藥組和阿托伐他汀組病變側(cè)腦組織含水量均低于MCAO組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(For24 h,P vs.MCAO:82.41％±0.59％ vs.85.47％±0.41％,P＜0.05;A+P vs.MCAO:80.20％±1.02％vs.85.47％±0.41％,P＜0.05;A vs.MCAO:81.67±0

10、.58％vs.85.47％±0.41％,P＜0.05.For72 h,P vs.MCAO:82.59％±0.43％ vs.85.95％±0.31％,P＜0.05;A+P vs.MCAO:80.99％±0.89％ vs.85.95％±0.43％,P＜0.05;A vs.MCAO:81.37±1.32％ vs.85.95％±0.43％,P＜0.05.)。并且在梗塞后24h聯(lián)合用藥組病變側(cè)腦組織含水量明顯低于普羅布考組或阿托伐他汀組,差異有統(tǒng)

11、計(jì)學(xué)意義(A+P vs.P:80.20％±1.02％ vs.82.41％±0.59％,P＜0.05;A+P vs.A:80.20％±1.02％ vs.81.67±0.58％,P＜0.05)。
　　 4 Sham組無梗死灶。與MCAO組相比,普羅布考和阿托伐他汀聯(lián)合用藥組梗死體積明顯減小(P＜0.05),普羅布考組或阿托伐他汀單獨(dú)應(yīng)用組與MCAO組相比,梗塞體積無明顯減小。
　　 5普羅布考組和聯(lián)合用藥組Prx2,Foxo

12、3a和Nrf2的陽性細(xì)胞數(shù)、蛋白水平及mRNA水平表達(dá)均增高,與MCAO組相比結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),阿托伐他汀組與MCAO組相比結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 6激光掃描共聚焦技術(shù)顯示Sham組腦組織無明顯的IgG外滲,MCAO組、普羅布考組和阿托伐他汀組病變側(cè)腦組織可見大量斑片狀呈綠色熒光的IgG,聯(lián)合用藥組IgG含量減少。
　　 7與假手術(shù)組相比,腦缺血后claudin-5表達(dá)明顯下降。聯(lián)合用藥組可以上調(diào)缺血腦