TSP-1及其受體CD47在大鼠腎缺血再灌注損傷大鼠模型中的作用及機(jī)制初步探討.pdf

1、目的:腎缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury, IRI）是急性腎損傷(acute kidney injury, AKI)重要的組織病理學(xué)機(jī)制。由IRI引起的AKI是一個(gè)重要的臨床問題，盡管AKI的治療方法不斷改進(jìn)，但是腎IRI仍與AKI的發(fā)病率和死亡率密切相關(guān)。腎IRI的發(fā)生機(jī)制很復(fù)雜，且并未完全闡明，與氧自由基、內(nèi)皮功能紊亂、炎癥損傷、細(xì)胞壞死和凋亡等多方面均有關(guān)。已證實(shí)氧化應(yīng)激產(chǎn)生的活性氧(reac

2、tive oxygenspecies，ROS)在腎IRI中發(fā)揮了重要作用。在正常腎臟組織，基質(zhì)蛋白血小板反應(yīng)蛋白-1(thrombospondin-1，TSP-1)表達(dá)量很少。但在缺氧條件下，多種細(xì)胞可以合成TSP-1。有研究表明，TSP-1與AKI的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，同樣也與慢性腎臟病的進(jìn)展關(guān)系密切。因此，人們越來越多的關(guān)注TSP-1在急慢性腎臟病變中的地位。CD47又被稱為整合素相關(guān)蛋白(integrin-associated pro

3、tein，IAP)，是TSP-1的同源受體之一，它在腎臟廣泛表達(dá)，但它在腎實(shí)質(zhì)和間質(zhì)細(xì)胞促進(jìn)腎損傷的機(jī)制還不清楚。因此，本研究通過構(gòu)建腎IRI大鼠模型，觀察TSP-1及其受體CD47在IRI大鼠腎臟的分布情況及表達(dá)變化，以及血ROS的變化和腎組織氧化應(yīng)激指標(biāo)的變化，研究TSP-1、CD47在腎IRI時(shí)的表達(dá)及分布，以及與氧化應(yīng)激的關(guān)系，探討其在腎IRI發(fā)病機(jī)制中的作用。
　　方法:成年雄性SD大鼠42只，隨機(jī)分為正常對照組(n=5

4、)、假手術(shù)組(sham group，SG)(n=5)和模型組(n=32)，模型組下設(shè)IRI后1h、6h、12h、24h4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)8只大鼠。手術(shù)方式:將大鼠麻醉后，逐層開腹暴露雙腎，用玻璃分針分離雙側(cè)腎動(dòng)脈，將已經(jīng)消毒的壓脈帶片段包裹在腎動(dòng)脈外層，將手術(shù)線系在壓脈帶片段外迅速打結(jié)阻斷腎血流，觀察腎臟顏色的變化。阻斷腎血流45min后，剪斷手術(shù)線，恢復(fù)腎臟供血，觀察腎臟顏色變化。逐層關(guān)腹，復(fù)蘇。觀察IRI后各組大鼠尿量變化，采用

5、全自動(dòng)生化分析儀檢測各組大鼠的腎功能，通過蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)、糖原染色(periodicacid-schiff stain，PAS)了解腎臟病理損害，通過透射電鏡觀察足細(xì)胞有無損傷、系膜基質(zhì)是否增生。采用流式細(xì)胞儀檢測血ROS變化，采用酶聯(lián)免疫吸附法測定腎組織中羥自由基和丙二醛的濃度，了解腎IRI損傷時(shí)的氧化應(yīng)激狀態(tài)。通過腎組織免疫組化，觀察TSP-1和CD47蛋白在腎臟的表

6、達(dá)及變化情況，通過免疫熒光雙染了解TSP-1及其受體CD47在腎IRI時(shí)是否存在共表達(dá)。
　　結(jié)果:與正常對照組和假手術(shù)組相比，IRI各組大鼠尿量明顯減少;腎IRI各組血肌酐(serum creatinine，Scr)和尿素氮（urea nitrogen，BUN）明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);隨著缺血再灌注后時(shí)間的延長，腎小管出現(xiàn)不同程度的擴(kuò)張、變性與壞死，間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤、充血水腫等變化。各組間腎小管HE染色病理

7、損傷評分差異顯著，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);通過透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)腎IRI各組大鼠腎小球足細(xì)胞足突消失、系膜基質(zhì)增生明顯，足細(xì)胞計(jì)數(shù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而腎IRI各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);紅細(xì)胞中ROS熒光強(qiáng)度陽性率逐漸升高，腎組織中的羥自由基和丙二醛的濃度呈逐漸升高趨勢。在腎IRI早期，腎小管TSP-1、CD47表達(dá)即明顯增加，至腎IRI24h時(shí)TSP-1、CD47在殘存腎小管仍有較高表達(dá)。通過免

8、疫熒光雙染發(fā)現(xiàn)，在腎IRI腎小管TSP-1和CD47存在共表達(dá)。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)ROS熒光強(qiáng)度陽性率與羥自由基和丙二醛的濃度呈正相關(guān)，與Scr、BUN、腎小管損傷評分、TSP-1積分光密度、CD47積分光密度呈正相關(guān)，與足細(xì)胞計(jì)數(shù)呈負(fù)相關(guān)。
　　結(jié)論:通過簡易手術(shù)阻斷雙側(cè)腎動(dòng)脈血流，可以成功建立大鼠腎IRI模型。腎IRI后引起腎組織和全身的氧化應(yīng)激反應(yīng)，引起腎臟組織結(jié)構(gòu)損害，足細(xì)胞損傷，腎功能異常。腎IRI時(shí)大鼠腎臟TSP-1和CD