手性釕配合物Λ-WH0402抗瘤活性及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、順鉑是全球三大抗腫瘤藥物之一,它的廣泛使用奠定了對(duì)金屬抗腫瘤藥物的肯定,釕配合物具有與鉑相同的化學(xué)結(jié)構(gòu)與性質(zhì),被認(rèn)為是最有前途的金屬抗癌藥物之一。由于順鉑嚴(yán)重的毒副作用,促使人們開(kāi)始關(guān)注并研究與鉑具有相近抗腫瘤活性的金屬釕配合物。
　　 近年來(lái),大多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)釕配合物有低毒性、易吸收并可很快排泄的特點(diǎn),由于配體和金屬離子的協(xié)同作用,其藥理活性有增強(qiáng)的趨勢(shì)。這類化合物在腫瘤中分布濃度高說(shuō)明易于被腫瘤組織吸收,并且具有與鉑類化合物更

2、佳的生物活性與更低毒性,有可能成為活性比順鉑更強(qiáng)的新型抗腫瘤藥物,經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾有望成為最有前途的抗癌藥物之一。
　　 前期工作,通過(guò)設(shè)計(jì)合成不同的配體,改變輔助配體,以拆分的方法設(shè)計(jì)合成出了一系列手性釕聯(lián)吡啶和手性釕菲噦啉配合物,并對(duì)這些化合物進(jìn)行了表征,同時(shí)研究其Λ－異構(gòu)體和△一異構(gòu)體,得出Λ－異構(gòu)體比△-異構(gòu)體活性強(qiáng)大,經(jīng)過(guò)一系列篩選,從眾多手性釕配合物中篩選出活性最好的釕配合物Λ－[Ru(bpy)2(o-tFPIP)](C

3、l)2,即Λ－WH0402。
　　 本課題從細(xì)胞生物學(xué)、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)、分子生物學(xué)、病理形態(tài)學(xué)等方面,以順鉑的抗瘤作用為對(duì)照,通過(guò)篩選Λ－WH0402敏感腫瘤細(xì)胞株,檢測(cè)Λ－WH0402對(duì)敏感腫瘤株的抗腫瘤活性；應(yīng)用抗腫瘤轉(zhuǎn)移、抑制血管作用等實(shí)驗(yàn),研究了手性釕配合物Λ－WH0402的抗腫瘤活性作用,并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。
　　 方法
　　 1.通過(guò)MTT法篩選對(duì)Λ－WH0402敏感的腫瘤細(xì)胞株,并以順鉑為對(duì)照,

4、通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Λ－WH0402的療效與毒性,確定對(duì)Λ－WH0402進(jìn)行研究的必要性。
　　 2.通過(guò)細(xì)胞爬片觀察、掃描電鏡觀察、腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)曲線觀察、裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)觀察Λ－WH0402對(duì)敏感腫瘤株生長(zhǎng)的抑制作用；通過(guò)流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、熒光顯微鏡觀察、凋亡蛋白檢測(cè)觀察Λ-WH0402對(duì)敏感腫瘤株誘導(dǎo)凋亡的作用,分析Λ-WH0402對(duì)敏感腫瘤株的抗腫瘤活性作用機(jī)制。
　　 3.Λ-WH0402敏感腫瘤細(xì)胞株HCCLM6為高

5、轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細(xì)胞株,通過(guò)體外侵襲、運(yùn)動(dòng)、粘附實(shí)驗(yàn),體內(nèi)原位移植轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn),觀察Λ-WH0402對(duì)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的影響。
　　 4.通過(guò)Λ-WH0402對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC的MTT實(shí)驗(yàn)、內(nèi)皮細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)、實(shí)驗(yàn)性體內(nèi)血道肺轉(zhuǎn)移的影響,觀察Λ-WH0402對(duì)腫瘤血管的抑制作用。
　　 結(jié)果
　　 1.體外應(yīng)用MTT生長(zhǎng)曲線動(dòng)態(tài)分析,對(duì)10種人腫瘤細(xì)胞株進(jìn)行篩選,獲得Λ-WH0402敏感腫瘤株為肝細(xì)胞癌高轉(zhuǎn)移腫瘤

6、細(xì)胞株HCCLM6。
　　 2.通過(guò)體外MTT實(shí)驗(yàn),體內(nèi)裸鼠及C57小鼠實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示Λ-WH0402的療效與順鉑接近,兩者之間差異無(wú)顯著性(P=0.028)；急性毒性結(jié)果顯示,Λ-WH0402的LD50為11.66 mg/kg。
　　 3.倒置顯微鏡觀察、細(xì)胞爬片觀察、掃描電鏡觀察,結(jié)果顯示對(duì)照組HCCLM6細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好,實(shí)驗(yàn)組隨Λ-WH0402劑量增加或培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞狀態(tài)逐漸惡化,生長(zhǎng)明顯受到抑制。流式細(xì)胞

7、儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布,結(jié)果顯示當(dāng)濃度達(dá)0.312μg/ml作用24h、48 h后,細(xì)胞周期主要阻滯在G0/G1期,當(dāng)濃度達(dá)0.625、1.25μg/ml作用24h、48h后,細(xì)胞周期主要阻滯在S期。流式細(xì)胞儀、熒光染色、凋亡蛋白檢測(cè),結(jié)果顯示Λ-WH0402能夠誘導(dǎo)HCCLM6細(xì)胞凋亡。
　　 4.體內(nèi)裸鼠實(shí)驗(yàn),在裸鼠右側(cè)脅部皮下接種1×106、左側(cè)接種2×105 HCCLM6細(xì)胞,建立雙側(cè)腫瘤小鼠模型,成瘤后次日在左側(cè)腫瘤皮下注

8、射生理鹽水,右側(cè)腫瘤的皮下注射水溶性Λ-WH0402,結(jié)果用雙因素方差分析得出,Λ-WH0402用藥組與未用藥組裸鼠移植瘤體積,有顯著性差異(F=20.242,P=0.001),瘤重用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn),組間的瘤重有顯著性差異(t=9.363,P=0.000),Λ-WH0402具有抑制HCCLM6裸鼠成瘤作用。
　　 5.體外侵襲、粘附、運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Λ-WH0402能夠在體外抑制HCCLM6細(xì)胞的侵襲粘附及運(yùn)動(dòng)能力；動(dòng)物體內(nèi)原

9、位移植實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Λ-WH0402能夠在裸鼠體內(nèi)明顯抑制原位移植后肝、肺、腹腔和腹壁轉(zhuǎn)移。
　　 6.內(nèi)皮細(xì)胞的MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Λ-WH0402對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制作用高于其敏感株HCCLM6細(xì)胞；內(nèi)皮細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)表明,Λ-WH0402能夠抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移；小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)性血道肺轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)顯示,Λ-WH0402用藥組較對(duì)照組肺轉(zhuǎn)移動(dòng)物數(shù)(x2=4.000 P=0.046)、肺轉(zhuǎn)移率、肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)(t=-6.357 P=0.0

10、00)明顯減少。
　　 結(jié)論
　　 1.應(yīng)用10株人腫瘤細(xì)胞株進(jìn)行增殖活性篩選,得出肝細(xì)胞癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株HCCLM6是Λ-WH0402的敏感腫瘤細(xì)胞株。與順鉑相比較,Λ-WH0402抗瘤活性及急性毒性與順鉑接近。
　　 2.Λ-WH0402通過(guò)阻滯細(xì)胞的DNA合成、抑制S期→G2期的轉(zhuǎn)化而抑制HCCLM6細(xì)胞的生長(zhǎng),通過(guò)上調(diào)P53和Bax的表達(dá),下調(diào)Bcl-2的表達(dá)而誘導(dǎo)HCCLM6細(xì)胞的凋亡。
　　 3

11、.Λ-WH0402抑制HCCLM6的體外粘附、侵襲及運(yùn)動(dòng)能力,在體內(nèi)抑制肝細(xì)胞癌的實(shí)驗(yàn)性轉(zhuǎn)移能力。
　　 4.Λ-WH0402對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC增殖抑制作用高于HCCLM6,能夠抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移,抑制小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)性血道肺轉(zhuǎn)移。
　　 本研究的創(chuàng)新之處
　　 應(yīng)用 Λ-WH0402對(duì)10種人腫瘤細(xì)胞株進(jìn)行體外活性篩選,發(fā)現(xiàn)Λ-WH0402對(duì)10種人腫瘤細(xì)胞株有不同程度抑瘤作用,其中肝細(xì)胞癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株HCCLM