氟絡(luò)草酮睪丸毒性及其機(jī)制研究.pdf

1、氟絡(luò)草酮(FLC)是一種吡咯烷酮類除草劑，化學(xué)名稱為(3RS，4RS;3RS，4RS)-3-氯-4-氯甲基-1-（α，α，α-三氟間甲基）-2-吡咯烷酮。FLC在歐盟和北美國(guó)家中廣泛應(yīng)用，國(guó)內(nèi)也已經(jīng)引入該藥，已在中國(guó)農(nóng)藥信息網(wǎng)（ICAMA）獲得臨時(shí)登記。文獻(xiàn)公布的FLC毒性研究資料非常少，僅JOURNAL OFANDROLOGY在1986年發(fā)表的兩篇會(huì)議文摘，指出FLC可引起雄性大鼠出現(xiàn)睪丸萎縮，精子數(shù)量和質(zhì)量下降，血清卵泡刺激素(FS

2、H)升高，生殖功能下降。2010年底，歐洲食品安全局(European FoodSafety Authority(EFSA))公布的FLC毒性評(píng)價(jià)報(bào)告指出，F(xiàn)LC具有可能的雄性生殖毒性，其毒作用靶器官是睪丸與附睪，主要表現(xiàn)為精子數(shù)量下降、異常增多，Sertoli細(xì)胞（支持細(xì)胞）空泡化。2011年3月，歐盟委員會(huì)健康與消費(fèi)者保護(hù)總司在發(fā)布的報(bào)告中指出FLC是可能的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物。本課題的研究目的包括評(píng)價(jià)FLC對(duì)SD大鼠睪丸的影響、FLC

3、誘導(dǎo)生精細(xì)胞凋亡及其可能機(jī)制探索和FLC對(duì)Sertoli細(xì)胞的損傷作用。通過(guò)建立SD雄性大鼠FLC暴露模型和Sertoli-生精細(xì)胞共培養(yǎng)、原代培養(yǎng)Sertoli細(xì)胞模型，評(píng)價(jià)FLC的睪丸毒性，探究其發(fā)生的主要通路機(jī)制，為FLC健康危險(xiǎn)度評(píng)價(jià)提供基礎(chǔ)資料，并為認(rèn)識(shí)類似結(jié)構(gòu)除草劑的生殖毒性提供借鑒。
　　一、FLC對(duì)SD大鼠睪丸的影響
　　40只SD雄性大鼠隨機(jī)分為溶劑對(duì)照組和FLC低(30mg/kg bw/d)、中(150m

4、g/kg bw/d)、高(750 mg/kg bw/d)劑量組，每組10只。SD大鼠經(jīng)灌胃染毒，給藥容劑為1mL/100g bw，每日一次，連續(xù)灌胃給藥28天。染毒結(jié)束后，運(yùn)用睪丸組織病理檢查、曲細(xì)精管超微結(jié)構(gòu)電鏡觀察、附睪尾精子計(jì)數(shù)和血清睪酮(T)水平等指標(biāo)，評(píng)價(jià)FLC的睪丸毒性。應(yīng)用試劑盒檢測(cè)睪丸組織中丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、過(guò)氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽還

5、原酶(GSH-GR)和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GSH-ST)水平。
　　1.FLC影響睪丸組織氧化應(yīng)激平衡。其中，中、高劑量組脂質(zhì)過(guò)氧化標(biāo)志物MDA含量明顯增加，各劑量組GSH含量均明顯下降，與對(duì)照比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？寡趸窼OD、CAT、GSH-Px、GSH-GR和GSH-ST，均在FLC的影響下出現(xiàn)了不同程度的活力下降，其中高劑量組與對(duì)照組相比，以上抗氧化酶活力均出現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的下降;中劑量組除GSH-GR外，其它的抗氧化酶

6、均出現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的活力下降;低劑量組只有CAT和SOD活力顯著降低。
　　2.FLC對(duì)SD大鼠睪丸毒性主要表現(xiàn)為，高劑量組大鼠睪丸質(zhì)量、睪丸臟器系數(shù)、附睪質(zhì)量、血清T水平和附睪尾精子計(jì)數(shù)與對(duì)照相比顯著下降。睪丸組織病理檢查:中、高劑量組大鼠睪丸出現(xiàn)不同程度的損傷，包括:1）間質(zhì)水腫;2）曲細(xì)精管結(jié)構(gòu)改變，萎縮;3）曲細(xì)精管生精上皮退化變性，生精細(xì)胞脫落至曲細(xì)精管管腔面;4）精母細(xì)胞、精子細(xì)胞死亡，管腔內(nèi)出現(xiàn)多核巨細(xì)胞;5）部分曲

7、細(xì)精管內(nèi)的生精細(xì)胞耗竭;6）支持細(xì)胞空泡化;7)生精細(xì)胞細(xì)胞核損傷。曲細(xì)精管電鏡觀察顯示生精細(xì)胞碎裂，精子細(xì)胞核仁、線粒體結(jié)構(gòu)異常。睪丸質(zhì)量，睪丸臟器系數(shù)、附睪質(zhì)量、附睪尾精子計(jì)數(shù)、血清睪酮和睪丸組織病理學(xué)檢查的基準(zhǔn)劑量95％置信區(qū)間下限值(95％ BMDL)分別為:65.7、76.0、23、2.4、99.9和12.9mg/kg bw/d。因此，本研究中附睪尾精子計(jì)數(shù)和睪丸組織病理?yè)p傷是對(duì)FLC暴露較為敏感的指標(biāo)。
　　二、FLC

8、誘導(dǎo)原代培養(yǎng)Sertoli-生精細(xì)胞凋亡及其可能信號(hào)通路機(jī)制
　　選擇出生后28-30天的雄性SD大鼠，采用兩步酶消化法制備Sertoli-生精細(xì)胞原代共培養(yǎng)體系。設(shè)立0.1％二甲基亞砜(DMSO)溶劑對(duì)照組和3個(gè)FLC劑量組(10-8、1o-7和10-6 M)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:
　　1.按以上劑量染毒6和24h后，開(kāi)展四甲基偶氮唑鹽(MTT)試驗(yàn)和生精細(xì)胞脫落計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示，相對(duì)溶劑對(duì)照組，染毒6h后，高劑量組細(xì)胞活力降至8

9、4.76±4.91(％)，染毒24 h后，各劑量組細(xì)胞活力分別降至72.16±2.53、50.62±4.13和44.30±12.66(％)。FLC染毒6、12、24和48 h后，各劑量組生精細(xì)胞脫落相對(duì)溶劑對(duì)照組，均顯著增加，且呈劑量-反應(yīng)關(guān)系和時(shí)間-劑量關(guān)系。
　　2.FLC染毒24 h后，收集劑量組與溶劑對(duì)照組脫落的生精細(xì)胞和培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞（包括貼壁培養(yǎng)的Sertoli細(xì)胞和黏附于其上的生精細(xì)胞），用annexinⅤ結(jié)合試驗(yàn)檢

10、測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況。與各自的溶劑對(duì)照組相比，各劑量組脫落的生精細(xì)胞中，早期凋亡細(xì)胞百分比明顯增高至24.25±2.88，33.08±2.43和29.23±2.54(％)，晚期凋亡/壞死細(xì)胞百分比明顯增高至17.35±1.16，23.14±1.06和20.70±0.48(％)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各劑量組共培養(yǎng)的Sertoli-生精細(xì)胞與對(duì)照組相比，早期凋亡細(xì)胞百分比顯著增加至10.80±1.86，13.52±0.72和16.62±0.35

11、(％)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但晚期凋亡/壞死細(xì)胞百分比沒(méi)有顯著性改變。
　　3.FLC染毒24、48和72h后，對(duì)Sertoli-生精細(xì)胞共培養(yǎng)體系中Fas/FasL、線粒體凋亡信號(hào)通路，以及核因子活化B細(xì)胞κ輕鏈增強(qiáng)子(NFκB)、促分裂素原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)的影響。FLC染毒24 h使中劑量組半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)8基因表達(dá)水平明顯升高;染毒24、48與72h后，高、中、低劑量組

12、均使B淋巴細(xì)胞瘤基因-2(Bcl-2)表達(dá)水平不同程度顯著下降，呈劑量-反應(yīng)關(guān)系和時(shí)間-反應(yīng)關(guān)系;FLC也上調(diào)了Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、Bel-2相關(guān)死亡啟動(dòng)子(Bad)、細(xì)胞色素c(Cytochrome c)、caspase9和caspase3基因的表達(dá)水平。FLC染毒72 h后，中、高劑量組NFκ B家族成員P50、 P65基因表達(dá)顯著上調(diào)。而高劑量FLC染毒24 h即可使高劑量組p38 MAPK基因表達(dá)明顯增加，染毒48和

13、72h，各劑量組p38絲裂素活化蛋白激酶(p38MAPK)基因表達(dá)都顯著增加，F(xiàn)LC對(duì)p38 MAPK基因表達(dá)的影響呈劑量-反應(yīng)和時(shí)間-反應(yīng)關(guān)系。
　　三、FLC對(duì)大鼠原代培養(yǎng)Sertoli細(xì)胞的毒作用
　　選擇出生后18-21天的雄性SD大鼠，采用兩步酶消化制備Sertoli-生精細(xì)胞，細(xì)胞接種24h后，用20 mmol/L Tris-HCl(pH=7.4)低滲處理，純化Sertoli細(xì)胞，建立Sertoli細(xì)胞原代培養(yǎng)體

14、系。通過(guò)原代Sertoli細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，確定純化后第2天開(kāi)始對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。設(shè)立0.1％ DMSO溶劑對(duì)照組和3個(gè)FLC劑量組(10-8、10-7和10-6M)。
　　1.按以上劑量染毒6、12和24h后，開(kāi)展MTT試驗(yàn)。染毒12h中、高劑量組原代培養(yǎng)Sertoli細(xì)胞增殖活力明顯下降。染毒24 h各劑量組細(xì)胞增殖活力分別降至74.7±2.5、56.1±4.4和52.3±6.4(％)，呈劑量-反應(yīng)關(guān)系。
　　2.免疫熒光染色試驗(yàn)

15、顯示，F(xiàn)LC染毒6、12、24、48與72h，緊密連接(TJ)的重要組成蛋白封閉蛋白(Occludin)與閉鎖小環(huán)蛋白-1(ZO-1)水平發(fā)生變化。染毒6h，中、高劑量組Occludin蛋白水平明顯變化。染毒24和48h，各劑量組誘導(dǎo)Occludin水平更明顯下降。高劑量染毒24h使Occludin基因表達(dá)顯著下調(diào)。FLC處理原代培養(yǎng)Sertoli細(xì)胞12h，中、高劑量組ZO-1蛋白表達(dá)顯著下調(diào)。染毒24和48h，各劑量組誘導(dǎo)ZO-1表

16、達(dá)下降更為明顯，呈劑量依賴性。染毒24、48與72h中、高劑量組ZO-1基因表達(dá)顯著下調(diào)，ZO-1基因水平隨著FLC濃度的增加而降低，呈劑量-反應(yīng)關(guān)系。
　　3.按以上劑量染毒6、12、24、48與72h，F(xiàn)LC對(duì)原代培養(yǎng)Sertoli細(xì)胞分泌功能相關(guān)基因表達(dá)有不同程度的影響。染毒24、48和72h，各劑量雄激素結(jié)合蛋白(ABP)基因表達(dá)隨劑量增加而下調(diào);染毒6、12和72h，高劑量組轉(zhuǎn)鐵蛋白Tf基因表達(dá)顯著下調(diào)。FLC染毒24和

17、48h抑制素B(INHB)基因表達(dá)隨FLC濃度的增加而降低，呈現(xiàn)劑量-反應(yīng)關(guān)系且各劑量組INHB基因表達(dá)與其相應(yīng)的溶劑對(duì)照組相比有顯著下調(diào)。染毒72h，只有高劑量組INHB基因表達(dá)明顯下調(diào)。
　　總結(jié)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，F(xiàn)LC染毒28天可使SD雄性大鼠睪丸組織氧化應(yīng)激水平升高、降低血清睪酮水平、睪丸曲細(xì)精管生精上皮退行性改變、Sertoli細(xì)胞空泡化，含吞噬小體的多核巨細(xì)胞增多，附睪尾精子計(jì)數(shù)下降。FLC可通過(guò)抑制Bcl-2和上調(diào)Bax

18、和Bad基因表達(dá)，使Sertoli-生精細(xì)胞共培養(yǎng)體系內(nèi)生精細(xì)胞發(fā)生凋亡。內(nèi)源性凋亡信號(hào)通路可能是其主要的凋亡機(jī)制之一。同時(shí)NFκB和p38 MAPK信號(hào)通路也可能通過(guò)抑制抗凋亡基因Bcl-2和/或上調(diào)促凋亡蛋白基因Bax和Bad表達(dá)，參與調(diào)節(jié)FLC引起的Sertoli-生精細(xì)胞共培養(yǎng)體系中細(xì)胞凋亡。在原代培養(yǎng)Sertoli細(xì)胞中，F(xiàn)LC降低了TJs結(jié)構(gòu)蛋白Occludin與ZO-1水平，影響B(tài)TB結(jié)構(gòu)完整性;同時(shí)Sertoli細(xì)胞旁分

19、泌的重要蛋白——ABP、Tf和INHB相關(guān)基因表達(dá)也在FLC影響下下調(diào)。說(shuō)明FLC對(duì)Sertoli細(xì)胞存在毒作用。
　　由此提出FLC睪丸毒性的可能機(jī)制是:
　　1)誘導(dǎo)睪丸組織產(chǎn)生氧化應(yīng)激，損傷睪丸組織結(jié)構(gòu)的完整性，破壞生精過(guò)程需要的特定微環(huán)境;
　　2)直接作用于生精細(xì)胞，通過(guò)內(nèi)源性信號(hào)通路主導(dǎo)，NFκ B信號(hào)通路和p38MAPK信號(hào)通路協(xié)助，誘導(dǎo)生精細(xì)胞凋亡，破壞正常的生精過(guò)程;
　　3)影響Sertoli