電針對(duì)創(chuàng)傷應(yīng)激大鼠外周和中樞TLR2-4以及炎性細(xì)胞因子表達(dá)的調(diào)節(jié)作用與機(jī)制.pdf

1、嚴(yán)重創(chuàng)傷時(shí)機(jī)體免疫系統(tǒng)出現(xiàn)異常。急性創(chuàng)傷造成的組織損傷、疼痛、失血、以及應(yīng)激反應(yīng)均不同程度地導(dǎo)致了免疫紊亂。研究發(fā)現(xiàn),大手術(shù)后的機(jī)體免疫功能異常主要為以炎癥反應(yīng)增強(qiáng)為代表的免疫反應(yīng)過度和淋巴細(xì)胞功能受抑為代表的免疫應(yīng)答低下。一方面淋巴細(xì)胞增殖功能受抑和白細(xì)胞介素-2等產(chǎn)生降低,造成手術(shù)后機(jī)體抗感染能力下降,疾病易感性增加;另一方面表現(xiàn)出以全身性炎癥反應(yīng)綜合征為特征的過度炎癥反應(yīng),而炎癥進(jìn)一步失控將造成多器官功能障礙,誘發(fā)多器官功能不全綜

2、合癥。如何糾正創(chuàng)傷應(yīng)激導(dǎo)致的免疫紊亂、提高機(jī)體的抗感染能力、盡早恢復(fù)健康,是人們普遍關(guān)心的一個(gè)問題。
　　 針灸是我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的瑰寶,具有經(jīng)濟(jì)、簡便、安全、有效的優(yōu)點(diǎn),長期的臨床實(shí)踐檢驗(yàn)已確認(rèn)其對(duì)某些疾病的確有效。近年來,針刺以其特有的雙向良性調(diào)節(jié)作用日益受到人們的重視,我們通過臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均證實(shí)電針能有效地改善創(chuàng)傷應(yīng)激導(dǎo)致的免疫抑制,主要是通過下丘腦—垂體—腎上腺軸、交感神經(jīng)系統(tǒng)以及內(nèi)源性阿片肽系統(tǒng)改善細(xì)胞免疫抑制。然而,以

3、往的研究多集中于針刺調(diào)節(jié)創(chuàng)傷應(yīng)激引起的免抑抑制,對(duì)于針刺調(diào)節(jié)創(chuàng)傷應(yīng)激引起的炎癥反應(yīng)過度方面,尚缺乏研究。
　　 最近的研究表明天然免疫系統(tǒng)的激活可能在創(chuàng)傷后免疫紊亂中起了始動(dòng)作用。Toll樣受體(Toll like receptor,TLR),作為重要的天然免疫調(diào)節(jié)分子,廣泛表達(dá)于各種免疫細(xì)胞及非免疫細(xì)胞表面,在病原體識(shí)別、炎癥和免疫應(yīng)答中都起著十分重要的作用。已有研究表明TLRs的高表達(dá)與許多炎癥性疾病有關(guān),可見TLR水平可影

4、響多種炎癥反應(yīng),TLRs表達(dá)的強(qiáng)弱以及是否激活將直接影響機(jī)體的炎癥反應(yīng)強(qiáng)弱并成為聯(lián)系天然免疫與獲得性免疫的紐帶。
　　 以往有研究表明,機(jī)體損傷后外周組織炎性細(xì)胞因子表達(dá)增加,電針能調(diào)節(jié)機(jī)體的炎癥反應(yīng)。那么,創(chuàng)傷應(yīng)激時(shí)發(fā)生的免疫紊亂是否和TLR2/4激活有關(guān),電針的抗炎作用是否和調(diào)節(jié)TLR2/4表達(dá)有關(guān),電針調(diào)節(jié)TLR2/4的途徑如何?這是本研究擬探討的第一個(gè)問題。
　　 除了免疫系統(tǒng)自身的功能變化及調(diào)節(jié)外,神經(jīng)系統(tǒng)也參

5、與了對(duì)創(chuàng)傷時(shí)免疫功能的調(diào)控。近年來的研究發(fā)現(xiàn),神經(jīng)元并非是神經(jīng)系統(tǒng)中參與對(duì)免疫系統(tǒng)調(diào)控的唯一要素,神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,尤其是小膠質(zhì)細(xì)胞在多種疾病的發(fā)病過程中也扮演著重要角色。疾病狀態(tài)下,如外周神經(jīng)損傷、單發(fā)性關(guān)節(jié)炎、腦缺血、慢性病理性疼痛、神經(jīng)退行性病變(如帕金森氏病,老年癡呆病)等時(shí),均觀察到小膠質(zhì)細(xì)胞的快速活化,釋放多種炎性細(xì)胞因子,而抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活動(dòng)則可顯著改善疾病的病程,產(chǎn)生諸如鎮(zhèn)痛、抗炎、促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)等效應(yīng),提示小膠質(zhì)細(xì)胞的激活

6、能導(dǎo)致痛敏,并且其持續(xù)激活與疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。我們以往的研究也發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷應(yīng)激后8h中樞小膠質(zhì)細(xì)胞被激活,產(chǎn)生IL-1β增多,但是小膠質(zhì)細(xì)胞激活是否和TLR2、4功能活動(dòng)增強(qiáng)有關(guān),小膠質(zhì)細(xì)胞激活在創(chuàng)傷后免疫功能紊亂中的作用,以及小膠質(zhì)細(xì)胞激活在電針調(diào)節(jié)創(chuàng)傷大鼠免疫功能中的作用仍不明。以往研究小膠質(zhì)細(xì)胞活化主要采用形態(tài)學(xué)方法分析小膠質(zhì)細(xì)胞的激活,在本研究課題中,我們擬采用Percoll法分離全腦小膠質(zhì)細(xì)胞,著重觀察創(chuàng)傷應(yīng)激模型大鼠小膠

7、質(zhì)細(xì)胞的功能變化,包括小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞表面TLR2/4表達(dá)以及炎性細(xì)胞因子的合成等變化,電針是否能通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)?干擾中樞小膠質(zhì)細(xì)胞功能能否增強(qiáng)電針調(diào)節(jié)手術(shù)后免疫功能的效應(yīng)?這是本研究擬探討的第二個(gè)問題。
　　 有研究顯示小膠質(zhì)細(xì)胞的激活和其表面表達(dá)的功能性β-腎上腺素能受體(β-AR)有關(guān);臨床研究結(jié)果顯示β-AR阻斷劑治療能明顯改善創(chuàng)傷病人尤其是腦損傷病人的預(yù)后;那么β-AR是否介導(dǎo)了創(chuàng)傷應(yīng)激時(shí)

8、小膠質(zhì)細(xì)胞的激活?激活β-AR對(duì)離體培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞的功能有何影響?這是本研究擬回答的第三個(gè)問題。
　　 綜上所述,本課題擬在創(chuàng)傷應(yīng)激(surgical trauma stress)引起的免疫功能紊亂大鼠模型上,從分子生物學(xué)到形態(tài)學(xué)等不同方面,從整體到離體等不同水平,采用Real-Time RCR、Western Blot、ELISA、免疫熒光化學(xué)、全腦小膠質(zhì)細(xì)胞分離技術(shù)以及離體小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)等技術(shù),觀察創(chuàng)傷應(yīng)激和電針對(duì)天然免疫

9、調(diào)節(jié)分子TLR2、4和炎性細(xì)胞因子的影響,從外周和中樞兩個(gè)不同角度探討針刺免疫調(diào)節(jié)的作用機(jī)理,結(jié)果如下:
　　 一、創(chuàng)傷應(yīng)激及電針對(duì)外周TLR2/4和炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響
　　 1.1創(chuàng)傷應(yīng)激后脾臟TLR2/4表達(dá)及炎性細(xì)胞因子表達(dá)的時(shí)程變化
　　 16只大鼠隨機(jī)分為4組,每組4只動(dòng)物,正常對(duì)照組大鼠4只,創(chuàng)傷應(yīng)激組共12只,分別于手術(shù)后2小時(shí),24小時(shí)和48小時(shí)后處死動(dòng)物,取脾臟組織抽提總RNA,采用RT-P

10、CR方法檢測組織中TLR2、TLR4和炎性細(xì)胞因子mRNA的時(shí)程變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-1β,IL-6和TNF-α mRNA創(chuàng)傷后2小時(shí)即升高,IL-1β和TNF-α創(chuàng)傷后24小時(shí)表達(dá)到達(dá)高峰,48小時(shí)mRNA表達(dá)恢復(fù)至正常水平。TLR2 mRNA的表達(dá)和IL-1β的表達(dá)呈現(xiàn)相同的變化趨勢,在創(chuàng)傷后24小時(shí)達(dá)到高峰。TLR4 mRNA的表達(dá)在幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)未檢測到有顯著性變化。根據(jù)該實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇創(chuàng)傷后24小時(shí)作為后面實(shí)驗(yàn)的觀察點(diǎn)。
　　

11、 1.2電針抑制創(chuàng)傷應(yīng)激大鼠脾臟TLR2/4表達(dá)
　　 采用Real-Time PCR和Western Blot方法檢測創(chuàng)傷應(yīng)激及電針后24小時(shí)脾臟TLR2/4的表達(dá)情況。Real-Time PCR結(jié)果顯示,創(chuàng)傷應(yīng)激后24小時(shí),脾臟TLR2 mRNA顯著升高(P＜0.001),電針能顯著抑制創(chuàng)傷應(yīng)激引起的TLR2 mRNA表達(dá)(P＜0.05),而TLR4mRNA表達(dá)與對(duì)照組相比無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Western Blot結(jié)果顯示

12、,創(chuàng)傷應(yīng)激24小時(shí)后,脾臟TLR2/4蛋白表達(dá)顯著增高,電針能完全阻斷創(chuàng)傷應(yīng)激導(dǎo)致的TLR2蛋白表達(dá),部分阻斷TLR4蛋白的表達(dá)。
　　 1.3電針抑制脾臟和循環(huán)血中炎性細(xì)胞因子表達(dá)
　　 TLR受體激活后會(huì)導(dǎo)致下游信號(hào)分子NF-κB的激活,并進(jìn)一步誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子合成。為檢測創(chuàng)傷應(yīng)激后外周炎性細(xì)胞因子的表達(dá)情況,采用Real-time PCR方法檢測創(chuàng)傷應(yīng)激和電針對(duì)脾臟IL-1β,IL-6,TNF-αmRNA的表達(dá),運(yùn)

13、用ELISA方法檢測脾臟和血液循環(huán)中三種細(xì)胞因子的蛋白分泌水平。結(jié)果顯示,創(chuàng)傷應(yīng)激24小時(shí)脾臟IL-1β,IL-6,TNF-α mRNA都顯示不同程度的增加,分別為IL-1β增加4.36倍,IL-6增加3.57倍,TNF-α增加5.18倍,電針能不同程度地降低升高的炎性細(xì)胞因子水平。ELISA結(jié)果顯示,創(chuàng)傷后24小時(shí)脾臟IL-1β和TNF-α蛋白表達(dá)水平較正常對(duì)照組相比顯著增加(P＜0.05,P＜0.05),電針能拮抗創(chuàng)傷應(yīng)激引起的IL

14、-1β和TNF-α的升高,創(chuàng)傷應(yīng)激24小時(shí)IL-6的水平未發(fā)生明顯變化。創(chuàng)傷應(yīng)激后外周血循環(huán)中炎性細(xì)胞因子的分泌結(jié)果顯示,創(chuàng)傷應(yīng)激24小時(shí)循環(huán)血中IL-1β,IL-6,TNF-α蛋白水平均有不同程度的升高,電針能拮抗IL-1β和TNF-α的升高,但是對(duì)IL-6的表達(dá)無顯著影響。
　　 1.4HPA軸及交感神經(jīng)系統(tǒng)在電針調(diào)節(jié)創(chuàng)傷應(yīng)激大鼠外周TLR2/4及炎性細(xì)胞因子表達(dá)中的作用
　　 1.4.1運(yùn)用雙側(cè)腎上腺切除術(shù),觀察H

15、PA軸在該過程中的作用
　　 為探討HPA軸在創(chuàng)傷應(yīng)激后TLR2、4表達(dá)增高及炎性反應(yīng)中的作用。我們采用雙側(cè)腎上腺切除術(shù),觀察腎上腺缺失對(duì)創(chuàng)傷大鼠免疫反應(yīng)的影響。大鼠在創(chuàng)傷應(yīng)激前3周施行雙側(cè)腎上腺切除術(shù),假腎上腺切除(sham)組施行同樣的背部手術(shù),但是保留腎上腺,同樣喂養(yǎng)3周后進(jìn)行造模。結(jié)果顯示,ADX切除3周后對(duì)正常大鼠脾臟TLR mRNA和炎性細(xì)胞因子表達(dá)無明顯影響。缺失腎上腺的大鼠創(chuàng)傷應(yīng)激后脾臟IL-1β mRNA和蛋白

16、表達(dá)以及外周血中IL-1β蛋白表達(dá)較創(chuàng)傷應(yīng)激組大鼠明顯升高(P＜0.05),說明腎上腺參與對(duì)創(chuàng)傷應(yīng)激時(shí)脾臟細(xì)胞因子分泌的調(diào)節(jié)。但是腎上腺切除對(duì)IL-6和TNF-α的表達(dá)未見有明顯影響。在缺乏腎上腺的創(chuàng)傷應(yīng)激大鼠上施行電針,發(fā)現(xiàn)電針可降低腎上腺切除的創(chuàng)傷大鼠脾臟和外周血中IL-1βmRNA和蛋白表達(dá)(P＜0.01,P＜0.01,P＜0.05,),降低脾臟IL-6mRNA(P＜0.05),降低脾臟和外周血中TNF-α蛋白表達(dá)(P＜0.05,

17、P＜0.05),降低TLR2mRNA表達(dá)(P＜0.05),說明電針調(diào)節(jié)創(chuàng)傷后TLR和炎性細(xì)胞因子分泌是不依賴于腎上腺的。
　　 1.4.2運(yùn)用化學(xué)性交感切斷術(shù)及beta-腎上腺素受體阻斷劑觀察交感神經(jīng)在該過程中的作用
　　 1.4.2.16-OHDA或propranolol對(duì)創(chuàng)傷應(yīng)激大鼠TLR2/4表達(dá)的影響
　　 創(chuàng)傷應(yīng)激后24h,大鼠麻醉處死后取脾臟,Real-Time PCR檢測TLR2/4mRNA表達(dá),W

18、estern Blotting分析TLR2/4蛋白水平。結(jié)果顯示,創(chuàng)傷應(yīng)激后,脾臟TLR2mRNA表達(dá)顯著升高(P＜0.001),預(yù)先給予6-OHDA或propranolol可阻斷創(chuàng)傷應(yīng)激誘導(dǎo)的TLR2mRNA的升高。TLR4mRNA在創(chuàng)傷應(yīng)激后24h未觀察到有明顯變化。Western Blotting方法檢測TLR2/4蛋白表達(dá),結(jié)果顯示,創(chuàng)傷應(yīng)激后24hTLR2和TLR4蛋白表達(dá)顯著增加(P＜0.05,P＜0.01)。6-OHDA或

19、propranolol均可拮抗創(chuàng)傷應(yīng)激導(dǎo)致的TLR2、4蛋白表達(dá)升高。
　　 1.4.2.26-OHDA或propranolol對(duì)創(chuàng)傷應(yīng)激大鼠脾臟炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響
　　 創(chuàng)傷應(yīng)激24h脾臟IL-1β,IL-6,TNF-α都顯示不同程度的增加,6-OHDA或propranolol能部分拮抗由于創(chuàng)傷應(yīng)激導(dǎo)致的IL-1β和TNF-αmRNA增加,但是對(duì)IL-6的表達(dá)無顯著影響。
　　 1.4.3電針對(duì)創(chuàng)傷應(yīng)激大鼠

20、外周血中去甲腎上腺素含量的影響
　　 大鼠創(chuàng)傷應(yīng)激2h后外周血中的去甲腎上腺素含量明顯升高(P＜0.001),電針能部分降低由創(chuàng)傷應(yīng)激導(dǎo)致的大鼠外周血中去甲腎上腺素含量升高(P＜0.001與創(chuàng)傷應(yīng)激組相比)。說明電針能抑制交感神經(jīng)末梢釋放去甲腎上腺素。
　　 小結(jié):
　　 上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,創(chuàng)傷應(yīng)激可導(dǎo)致大鼠外周TLR2、TLR4表達(dá)增加,炎性細(xì)胞因子合成和分泌增加,電針能抑制創(chuàng)傷后大鼠炎癥反應(yīng),這種抑制作用和電

21、針抑制創(chuàng)傷應(yīng)激后的交感神經(jīng)活動(dòng)有關(guān),腎上腺不參與電針調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。
　　 二、創(chuàng)傷應(yīng)激及電針時(shí)對(duì)中樞TLR2/4及炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響
　　 2.1創(chuàng)傷應(yīng)激及電針對(duì)中樞TLR2、TLR4表達(dá)的影響
　　 大鼠創(chuàng)傷應(yīng)激后24h,麻醉灌流處死后取下丘腦組織,Real-Time PCR方法檢測下丘腦組織TLR2、TLR4 mRNA表達(dá),Western Blot方法檢測蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示,下丘腦組織TLR2、TLR

22、4 mRNA在創(chuàng)傷后均有不同程度的升高,分別升高1.87倍(P＜0.05)和2.22倍(P＜0.01)。電針能完全阻斷由創(chuàng)傷引起的TLR2 mRNA升高,部分降低TLR4 mRNA升高。TLR2、TLR4的蛋白表達(dá)和mRNA表達(dá)呈現(xiàn)較為一致的變化,創(chuàng)傷24h后下丘腦TLR2、TLR4蛋白表達(dá)顯著升高(P＜0.01)。電針能抑制創(chuàng)傷應(yīng)激引起的TLR2、TLR4蛋白表達(dá)。
　　 2.2創(chuàng)傷應(yīng)激及電針對(duì)中樞炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響

23、>　　 創(chuàng)傷應(yīng)激后24h,麻醉灌流后取下丘腦,Real-time PCR方法檢測下丘腦組織IL-1β,IL-6,TNF-α mRNA表達(dá),ELISA方法炎性細(xì)胞因子蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示,下丘腦組織IL-1β,IL-6,TNF-α mRNA在創(chuàng)傷后均有不同程度的升高,分別升高2.33倍(P＜0.01)、2.47倍(P＜0.01)和3.22倍(P＜0.001)。電針能抑制由創(chuàng)傷引起的IL-1β和TNF-α mRNA升高,對(duì)IL-6 mR

24、NA表達(dá)有降低趨勢,但是統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著性差異(P＞0.05)。下丘腦組織IL-1β,IL-6,TNF-α的蛋白表達(dá)和mRNA表達(dá)呈現(xiàn)較為一致的變化,創(chuàng)傷24h后下丘腦IL-1β,IL-6,TNF-α蛋白表達(dá)顯著升高(P＜0.001,P＜0.01,P＜0.01),電針能抑制創(chuàng)傷應(yīng)激引起的IL-1β和TNF-α蛋白表達(dá)。
　　 2.36-OHDA或propranolol對(duì)創(chuàng)傷應(yīng)激大鼠中樞TLR2/4和炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響
　

25、　 大鼠創(chuàng)傷應(yīng)激后24h,麻醉灌流處死后取下丘腦組織,propranolol為造模前30min腹腔注射。結(jié)果顯示,外周化學(xué)性交感神經(jīng)切斷術(shù)對(duì)創(chuàng)傷應(yīng)激引起的下丘腦TLR2、TLR4 mRNA表達(dá)升高無顯著影響,而ip.propranolol可以抑制創(chuàng)傷應(yīng)激引起的TLR2、TLR4 mRNA表達(dá)升高(P＜0.05,P＜0.01)。同時(shí)檢測下丘腦炎性細(xì)胞因子在給予外周交感神經(jīng)切斷術(shù)和β-受體阻斷劑后的變化,結(jié)果顯示,6-OHDA對(duì)于創(chuàng)傷應(yīng)激

26、引起的IL-β,IL-6,TNF-αmRNA升高無顯著性影響,而β-受體阻斷劑propranolol能部分阻斷創(chuàng)傷應(yīng)激引起的IL-6,TNF-αmRNA升高(P＜0.01,P＜0.01)。
　　 小結(jié):
　　 上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,創(chuàng)傷應(yīng)激可導(dǎo)致大鼠中樞下丘腦TLR2、TLR4表達(dá)增加,炎性細(xì)胞因子合成和分泌增加,該作用是由中樞而非外周β-腎上腺素受體介導(dǎo)的。電針能抑制創(chuàng)傷應(yīng)激引起的中樞下丘腦TLR2、TLR4和炎性細(xì)胞因子

27、合成,提示電針能調(diào)節(jié)中樞的神經(jīng)免疫反應(yīng)。
　　 三、中樞小膠質(zhì)細(xì)胞在電針調(diào)節(jié)創(chuàng)傷應(yīng)激大鼠TLR2/4及炎性細(xì)胞因子表達(dá)中的作用
　　 3.1創(chuàng)傷應(yīng)激及電針后中樞小膠質(zhì)細(xì)胞的變化
　　 大鼠創(chuàng)傷應(yīng)激后24h灌流固定取腦,免疫熒光染色分析小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,分離中樞神經(jīng)系統(tǒng)單個(gè)核細(xì)胞,計(jì)數(shù),同時(shí)運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面TLR2、4表達(dá)變化,ELSA方法檢測炎性細(xì)胞因子表達(dá)水平。
　　 3.1.1創(chuàng)傷應(yīng)激及

28、電針后中樞小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化
　　 免疫熒光組織化學(xué)結(jié)果顯示,創(chuàng)傷應(yīng)激24h后下丘腦區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞大量激活,3天后仍有少量增加,7天基本恢復(fù)至正常水平。激活的小膠質(zhì)細(xì)胞胞體變大,突起變短、變厚、變少,呈阿米巴樣改變。電針能明顯抑制創(chuàng)傷應(yīng)激誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活。
　　 3.1.2創(chuàng)傷應(yīng)激及電針后中樞小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目的變化
　　 創(chuàng)傷應(yīng)激后24h,大鼠麻醉后灌流,取全腦,分離腦單個(gè)核細(xì)胞,正常大鼠分離中樞單個(gè)核細(xì)胞,經(jīng)

29、流式細(xì)胞儀鑒定,98％為CD-11b陽性細(xì)胞,故可認(rèn)為分離所得的單個(gè)核細(xì)胞基本為小膠質(zhì)細(xì)胞,計(jì)數(shù)分離的小膠質(zhì)細(xì)胞。結(jié)果顯示正常大鼠腦小膠質(zhì)細(xì)胞總數(shù)約為154.8±6.9(X104),創(chuàng)傷應(yīng)激24h中樞小膠質(zhì)細(xì)胞總數(shù)明顯增加(P＜0.01),總數(shù)為191.7±10.8(×104)。電針能明顯抑制創(chuàng)傷應(yīng)激大鼠中樞小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目,為163.9±8.3(×104)(P＜0.05)。
　　 3.1.3創(chuàng)傷應(yīng)激及電針后中樞小膠質(zhì)細(xì)胞TLR2

30、、TLR4表達(dá)的變化
　　 創(chuàng)傷后24h后,麻醉灌流取腦,分離中樞單個(gè)核細(xì)胞,運(yùn)用特異性抗體染色后在流式細(xì)胞儀上檢測細(xì)胞表面TLR2/4的表達(dá)。結(jié)果顯示,創(chuàng)傷應(yīng)激24h后大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞表面TLR2和TLR4表達(dá)明顯升高(P＜0.01,P＜0.01),電針能顯著降低創(chuàng)傷后小膠質(zhì)細(xì)胞表面表達(dá)TLR2和TLR4。
　　 3.1.4創(chuàng)傷應(yīng)激及電針后中樞小膠質(zhì)細(xì)胞炎性細(xì)胞因子表達(dá)的變化
　　 創(chuàng)傷后24h后,麻醉灌流取腦,

31、分離中樞單個(gè)核細(xì)胞,運(yùn)用ELISA方法分析創(chuàng)傷應(yīng)激后小膠質(zhì)細(xì)胞炎性細(xì)胞因子表達(dá)情況。結(jié)果顯示,創(chuàng)傷應(yīng)激24h后大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞IL-1β,IL-6,TNF-α蛋白表達(dá)在創(chuàng)傷后均有不同程度的升高,IL-1β從21.2±3.12升高到60.7±2.42pg/100ugprotein(P＜0.01vsControl組),IL-6從40.5±7.29升高到120.6±16.23pg/100ugprotein(P＜0.01vsControl組),T

32、NF-α從11.2±2.09升高到38.7±3.98pg/100ugprotein(P＜0.05vsControl組)。電針能抑制由創(chuàng)傷引起的IL-1β和TNF-α升高,對(duì)IL-6表達(dá)有降低趨勢,但是統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著性差異(P＞0.05)。
　　 3.2小膠質(zhì)細(xì)胞功能性阻斷劑Minocycline對(duì)創(chuàng)傷應(yīng)激和電針大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞TLR2/4及炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響
　　 3.2.1Minocycline對(duì)創(chuàng)傷應(yīng)激和電針后小膠

33、質(zhì)細(xì)胞數(shù)目的變化
　　 創(chuàng)傷應(yīng)激大鼠24h后小膠質(zhì)細(xì)胞總數(shù)明顯增加,為191.7±10.8(×104),造模前1h給予小膠質(zhì)細(xì)胞功能性阻斷劑Minocycline,創(chuàng)傷應(yīng)激大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量為158.0±8.0(×104),與創(chuàng)傷組相比,統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異(P＜0.001)。Minocycline+電針組小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量為148.5±11.4(×104)(P＜0.001,與創(chuàng)傷應(yīng)激組相比),說明小膠質(zhì)細(xì)胞抑制劑和電針能抑制創(chuàng)傷應(yīng)

34、激導(dǎo)致的中樞小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增多。
　　 3.2.2Minocycline對(duì)創(chuàng)傷應(yīng)激和電針后小膠質(zhì)細(xì)胞TLR2、TLR4表達(dá)的影響
　　 創(chuàng)傷應(yīng)激24h后大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞表面TLR2和TLR4表達(dá)明顯升高(P＜0.01,P＜0.01,與對(duì)照組相比),Minocycline能顯著降低創(chuàng)傷應(yīng)激后小膠質(zhì)細(xì)胞表面表達(dá)TLR2和TLR4(P＜0.01,P＜0.05,與創(chuàng)傷應(yīng)激組相比),電針和Minocycline合用可以抑制創(chuàng)傷應(yīng)激后

35、小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)TLR2和TLR4,但是和單用Minocycline相比無顯著性差異。
　　 3.2.3Minocycline對(duì)創(chuàng)傷應(yīng)激和電針大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響
　　 Minocycline阻斷創(chuàng)傷應(yīng)激引起的IL-1β、IL-6和TNF-α表達(dá),電針和Minocycline合用也能完全阻斷創(chuàng)傷應(yīng)激導(dǎo)致的炎性細(xì)胞因子表達(dá)。
　　 3.3Minocycline對(duì)創(chuàng)傷應(yīng)激大鼠脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響

36、r>　　 創(chuàng)傷應(yīng)激后24h取脾臟,分離脾臟單個(gè)核細(xì)胞,檢測ConA刺激的淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng),結(jié)果顯示,創(chuàng)傷應(yīng)激24h后大鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖能力受到明顯抑制(P＜0.01)。Ip.Minocycline能部分阻斷由創(chuàng)傷應(yīng)激造成的脾臟淋巴細(xì)胞增殖能力降低,與創(chuàng)傷組相比有明顯改善(P＜0.05),但與正常對(duì)照組相比仍有一定程度的抑制(P＜0.05)。提示小膠質(zhì)細(xì)胞參與創(chuàng)傷應(yīng)激誘導(dǎo)的免疫抑制,抑制小膠質(zhì)細(xì)胞功能能改善創(chuàng)傷后免疫狀態(tài)。
　　

37、 小結(jié):
　　 上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,創(chuàng)傷應(yīng)激直接激活小膠質(zhì)細(xì)胞,表現(xiàn)為小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增多,細(xì)胞表面TLR2、TLR4表達(dá)增加,炎性細(xì)胞因子表達(dá)增加。電針能抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活。小膠質(zhì)細(xì)胞參與創(chuàng)傷應(yīng)激引起的免疫抑制。
　　 四、β-腎上腺素能受體在創(chuàng)傷應(yīng)激大鼠中樞小膠質(zhì)細(xì)胞激活中的作用
　　 4.1β-腎上腺素能受體阻斷劑對(duì)創(chuàng)傷應(yīng)激大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞TLR及炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響
　　 β-腎上腺素能受體阻斷劑

38、可以抑制創(chuàng)傷大鼠下丘腦組織TLR和炎性細(xì)胞因子的表達(dá),是否是通過直接抑制了小膠質(zhì)細(xì)胞的活化。大鼠在創(chuàng)傷應(yīng)激前30minip.注射propranolol,創(chuàng)傷后24h灌流取腦,分離小膠質(zhì)細(xì)胞,檢測小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量,TLR2、TLR4表達(dá)和IL-1β,IL-6,TNF-α表達(dá)。
　　 4.1.1β-腎上腺素能受體阻斷劑對(duì)創(chuàng)傷應(yīng)激后小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目的變化
　　 創(chuàng)傷應(yīng)激大鼠24h后小膠質(zhì)細(xì)胞總數(shù)明顯增加,為191.7±10.8(×

39、104),事先運(yùn)用β-腎上腺素能受體阻斷劑propranolol后,創(chuàng)傷應(yīng)激大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量為188.0±18.0(×104)(P＞0.05,與創(chuàng)傷應(yīng)激組相比)。說明β-腎上腺素能受體對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量無顯著性影響。
　　 4.1.2β-腎上腺素能受體阻斷劑對(duì)創(chuàng)傷應(yīng)激后小膠質(zhì)細(xì)胞TLR2、TLR4表達(dá)的影響
　　 創(chuàng)傷應(yīng)激24h后大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞表面TLR2和TLR4表達(dá)明顯升高(P＜0.01,P＜0.01),β-腎上腺素

40、能受體阻斷劑能顯著降低創(chuàng)傷后小膠質(zhì)細(xì)胞表面表達(dá)TLR4(P＜0.05),對(duì)TLR2的表達(dá)無顯著性影響。提示β-腎上腺素能受體參與對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)TLR的調(diào)控。
　　 4.1.3β-腎上腺素能受體阻斷劑對(duì)創(chuàng)傷應(yīng)激大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響
　　 創(chuàng)傷應(yīng)激24h后大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞IL-1β,IL-6,TNF-α蛋白表達(dá)在創(chuàng)傷后均有不同程度的升高(P＜0.01,P＜0.01,P＜0.05與正常對(duì)照組相比)。Propra

41、nolol抑制由創(chuàng)傷應(yīng)激引起的IL-1β和IL-6升高,對(duì)TNF-α表達(dá)有降低趨勢,但是統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著性差異(P＞0.05)。
　　 4.2β-腎上腺素能受體激動(dòng)劑對(duì)離體培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞TLR及細(xì)胞因子合成的影響
　　 4.2.1β-腎上腺素能受體激活對(duì)離體培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞TLR2/4及炎性細(xì)胞因子合成的影響
　　 由于β-腎上腺素受體阻斷劑能阻斷創(chuàng)傷應(yīng)激誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞合成IL-1β和IL-6,本實(shí)驗(yàn)在培養(yǎng)的小

42、膠質(zhì)細(xì)胞上加入1uMβ-腎上腺素受體激動(dòng)劑Iso后,收集刺激前以及刺激后2h、6h、12h、24h的細(xì)胞和上清液,提取細(xì)胞總RNA,觀察激動(dòng)β-腎上腺素受體后能否直接刺激小膠質(zhì)細(xì)胞合成TLR和炎性細(xì)胞因子。結(jié)果顯示,1uMβ-腎上腺素受體激動(dòng)劑Iso不影響TLR2/4的表達(dá),各處理組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 但是,1uMβ-腎上腺素受體激動(dòng)劑Iso顯著增加IL-1β,TNF-α和IL-6mRNA合成,炎性細(xì)胞因子表達(dá)的達(dá)峰時(shí)間各

43、不相同,IL-1β mRNA在Iso刺激后2h合成達(dá)到峰值,IL-6和TNF-α mRNA的達(dá)峰時(shí)間分別為刺激后6h和12h。炎性細(xì)胞因子mRNA合成增加的同時(shí),蛋白表達(dá)水平也發(fā)生相應(yīng)的變化,IL-1β在Iso刺激后6h即檢測到增加,刺激后12h分泌達(dá)到峰值,24h后恢復(fù)至刺激前水平。IL-6的分泌在Iso刺激后2h即檢測到增加,刺激后6h分泌達(dá)到峰值,刺激后12h恢復(fù)至刺激前水平。TNF-α的合成遲于IL-1β和IL-6,Iso刺激1

44、2h后檢測到增加,24h后仍然在繼續(xù)升高。結(jié)果提示激活小膠質(zhì)細(xì)胞上的β-AR能刺激炎性細(xì)胞因子分泌。
　　 4.2.2β-腎上腺素能受體激動(dòng)劑劑量依賴性增加小膠質(zhì)細(xì)胞IL-1βmRNA合成
　　 小膠質(zhì)細(xì)胞在不同劑量Iso刺激下,收集2h后的細(xì)胞,用Real-Time PCR方法檢測細(xì)胞IL-1β表達(dá)水平。結(jié)果顯示,在0.01μM、0.1μM、1μM、10μM不同濃度Iso作用下,IL-1β mRNA合成呈劑量依賴式增加

45、。
　　 4.2.3β-腎上腺素能受體激動(dòng)劑誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞IL-1βmRNA合成的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制
　　 β-腎上腺素受體激活后可以通過PKA經(jīng)典途徑激活下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,也有實(shí)驗(yàn)表明,β-受體激活后通過MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑促進(jìn)細(xì)胞因子分泌。本實(shí)驗(yàn)在離體培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞,運(yùn)用H89(PKA阻斷劑),U0126(p-ERK抑制劑),SB203580(p-P38抑制劑)和SP600125(p-JNK抑制劑)等藥物干預(yù),觀察Iso

46、對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞合成細(xì)胞因子的影響。小膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)1μMIso刺激后,收集刺激前和刺激5min、15min、30min和60min的細(xì)胞,用WesternBlot方法分析ERK1/2,p38和JNK的蛋白磷酸化變化,結(jié)果顯示1μMIso刺激5min后,磷酸化p-ERK表達(dá)明顯增加,刺激后15min仍維持在較高水平,刺激后30min基本恢復(fù)正常。磷酸化p38和p-ERK呈現(xiàn)相同的變化趨勢,1μMIso刺激后5min開始增加,刺激后15min達(dá)到

47、峰值,刺激后60min恢復(fù)正常。磷酸化JNK1/2在1μMIso刺激后無顯著性變化。小膠質(zhì)細(xì)胞預(yù)先用不同的抑制劑,包括H89(10μM,PKA inhibitor),U0126(10μM,ERK1/2 inhibitor),SB203580(10μM,P38 inhibitor),或SP600125(10μM,JNK inhibitor),預(yù)處理30min后,再加入1μMIso刺激2h,收集細(xì)胞,經(jīng)real-timePCR檢測IL-1β

48、mRNA表達(dá)情況,結(jié)果顯示,1μMIso刺激誘導(dǎo)的IL-1β mRNA表達(dá)可以被U0126和SB203580所阻斷,但是不能被H89和SP600125所阻斷。提示Iso誘導(dǎo)的細(xì)胞因子表達(dá)是通過ERK1/2和P38信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,而非PKA或INK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
　　 小結(jié):
　　 創(chuàng)傷應(yīng)激導(dǎo)致的小膠質(zhì)細(xì)胞激活部分是由中樞β-腎上腺素能受體介導(dǎo)的。綜上所述,本論文獲得以下結(jié)論:
　　 (1)創(chuàng)傷應(yīng)激可導(dǎo)致大鼠外周TL

49、R2/TLR4激活,炎癥反應(yīng)增強(qiáng),電針通過抑制創(chuàng)傷應(yīng)激后的交感神經(jīng)活動(dòng)改善創(chuàng)傷后免疫功能紊亂。腎上腺不參與電針調(diào)節(jié)創(chuàng)傷應(yīng)激后機(jī)體的炎癥反應(yīng)。
　　 (2)創(chuàng)傷應(yīng)激直接激活小膠質(zhì)細(xì)胞,表現(xiàn)為小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增多,細(xì)胞表面TLR2、TLR4表達(dá)增加,炎性細(xì)胞因子表達(dá)增加。小膠質(zhì)細(xì)胞的激活參與創(chuàng)傷應(yīng)激引起的免疫抑制。電針能抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活,這可能是電針改善免疫功能的作用途徑之一。
　　 (3)創(chuàng)傷應(yīng)激導(dǎo)致的小膠質(zhì)細(xì)胞激活部分