siRNA干擾FPR后U87細胞裸鼠腦原位移植瘤生物學行為及血管生成特點改變及機制.pdf

1、近年來，趨化因子及其受體在惡性腫瘤的生長、侵襲以及轉(zhuǎn)移中的作用越來越受重視。研究顯示，一些表達在正常細胞的與特定生理或病理過程相關(guān)的趨化因子受體也可能表達于腫瘤細胞，而且在腫瘤演進中發(fā)揮作用。腫瘤演進是復(fù)雜的過程，涉及瘤細胞和宿主多方面、多階段的相互作用。其中，瘤細胞的增殖和運動能力增強、釋放蛋白水解酶增多、產(chǎn)生過多的促血管生成因子等重要改變，以及在瘤細胞與宿主相互作用過程中其調(diào)節(jié)紊亂是重要的研究內(nèi)容，有關(guān)的受體也可能作為新的治療措施的

2、靶點。 FPR是吞噬細胞表達的一種G蛋白偶聯(lián)受體，受內(nèi)源性(如線粒體蛋白來源)或外源性(如細菌蛋白來源)配體N-甲?；膄MLF激活后使細胞趨化能力增強，并釋放炎癥介質(zhì)，從而發(fā)揮免疫功能。最近研究發(fā)現(xiàn)，此受體也表達于惡性膠質(zhì)瘤細胞，而且，體外激活可使瘤細胞運動能力增強，VEGF產(chǎn)生增多。惡性膠質(zhì)瘤的特點是侵襲能力強，血管內(nèi)皮增生活躍，容易出現(xiàn)壞死，而壞死物中的fMLF正好是FPR的激動劑，所以二者的存在和相互作用可能是惡性膠質(zhì)

3、瘤細胞增殖、侵襲和促血管生成的重要機制之一。 為研究惡性膠質(zhì)瘤中FPR受體表達和激活在促進瘤細胞生長、侵襲與促血管生成中的作用和機制，本研究將已經(jīng)成功地利用siRNA干擾了FPR的GBM細胞株U87應(yīng)用于實驗中，從以下三個方面進行了研究：(1)檢測siRNA干擾FPR后的U87細胞(FPR-siRNA U87)的VEGF、MMP-2和-9蛋白表達以及相應(yīng)配體fMLF激活后表達的改變：(2)觀察siRNA干擾FPR后的U87細胞裸

4、鼠腦原位移植瘤的生長、分化、侵襲和血管生成相關(guān)的形態(tài)學改變；(3)進一步檢測siRNA干擾FPR后的U87細胞裸鼠腦原位移植瘤組織中VEGF、MMP-2和-9蛋白表達改變，同時檢測膠質(zhì)瘤分化標志物vimentin。主要結(jié)果和結(jié)論如下： 1.用轉(zhuǎn)染了針對FPR構(gòu)建的siRNA的U87細胞(FPR-siRNA U87)，以野生型U87細胞和Mock轉(zhuǎn)染細胞(Mock)為對照進行體外培養(yǎng)，并用其已知最佳濃度(10.nmol/L)的特異

5、性配體fMLF刺激，采用ELIsA方法檢測培養(yǎng)6小時后細胞上清液中VEGF、MMP-2和-9蛋白含量，發(fā)現(xiàn)FPR-siRNA U87細胞VEGF表達顯著低于對照細胞，且表達不象對照細胞一樣受fMLF刺激影響。FPR-siRNA U87細胞MMP-9表達低于對照細胞，但與對照細胞一樣，fMLF刺激后分泌改變不明顯。而FPR-siRNA U87細胞的MMP-2表達卻比未受fMLF刺激的對照細胞高，但Mock細胞受刺激后表達明顯升高。這些結(jié)果

6、說明VEGF表達與受體激活關(guān)系最為密切，而MMP-2和-9表達與受體表達有某種關(guān)系，但可能還受其它因素影響和調(diào)節(jié)，需要結(jié)合體內(nèi)研究說明。 2.用免疫細胞化學方法檢測FPR-siRNA U87細胞中VEGF蛋白和細胞膜上FPR受體表達，發(fā)現(xiàn)二者染色強度都比對照細胞者低。用RT-PCR檢測上述條件下培養(yǎng)細胞的VEGF、MMP-2和-9的mRNA表達，發(fā)現(xiàn)FPR-siRNA U87細胞VEGF的mRNA表達出現(xiàn)與上清液中蛋白表達相似的

7、改變趨勢，而MMP-2和-9的mRNA表達在6小時未顯示表達差異。這些結(jié)果同樣說明VEGF表達與受體表達和激活關(guān)系密切，而MMP-2和-9表達可能還受其它因素影響和調(diào)節(jié)，包括轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)。 3.以野生型U87細胞和Mock細胞為對照，將FPR-siRNA U87細胞原位接種到裸鼠腦內(nèi)，比較觀察不同時間點(1w、2w、4w、5w及6w)移植瘤大小，光鏡和電鏡下觀察其生長、分化、侵襲和促血管生成相關(guān)的形態(tài)學特點，發(fā)現(xiàn)FPR沉默后移植瘤

8、生長明顯較緩慢，沒有對照細胞移植瘤在5w至6w出現(xiàn)的加速生長；細胞分化較高、核分裂像少、侵襲能力較弱，移植瘤中血管數(shù)明顯較少，其形態(tài)和結(jié)構(gòu)較接近正常。這些結(jié)果說明該受體體內(nèi)表達和激活與惡性膠質(zhì)瘤生長、分化、侵襲和促血管生成能力有關(guān)。 4.用Western blotting方法檢測發(fā)現(xiàn)FPR-siRNA U87細胞裸鼠腦原位移植瘤組織中VEGF、MMP-2和-9蛋白表達下降，用免疫組化方法檢測瘤組織中上述蛋白，發(fā)現(xiàn)VEGF和MMP

9、-9蛋白表達明顯降低。另外，vimentin染色明顯減弱。這些結(jié)果進一步說明該受體表達和激活可通過介導(dǎo)或影響VEGF、MMP-2和-9表達，促進移植瘤侵襲和血管生成，還說明受體表達與裸鼠腦原位移植瘤細胞分化有關(guān)。 本研究說明，用siRNA沉默U87細胞的FPR可使細胞分化提高、增殖減慢，并通過下調(diào)MMP-2及-9和VEGF而削弱其侵襲和促血管生成能力，反過來說明該受體在惡性膠質(zhì)瘤中的生長、侵襲和促血管生成中的作用，因而可作為抗膠