雌激素促進心肌細(xì)胞CSE表達和H2S生成的分子機制.pdf

1、心血管疾病的發(fā)病存在明顯的性別差異。絕經(jīng)前女性心血管疾病發(fā)病率明顯低于男性，而絕經(jīng)后這種優(yōu)勢喪失。絕經(jīng)期婦女最顯著的生理變化就是體內(nèi)雌激素水平的降低，雌激素的心血管保護作用已有文獻報道，然而具體機制尚未完全闡明。硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類新的內(nèi)源性氣體信號分子。在心臟組織中，H2S是以L-半胱氨酸為底物，在胱硫醚γ裂解酶（cystathionineγ lyase，CSE）的催化下生成的。近年來，

2、內(nèi)源性H2S作為一種內(nèi)源性心肌保護機制也受到了廣泛關(guān)注。本實驗室前期工作已經(jīng)發(fā)現(xiàn)雌激素替代可以改善OVX大鼠氧化應(yīng)激損傷，同時雌激素可以促進CSE表達，然而內(nèi)源性H2S是否參雌激素抗心肌氧化損傷過程則尚未可知。因此，本課題首先明確了內(nèi)源性H2S在雌激素抗心肌氧化應(yīng)激損傷過程中的作用，進而探討了雌激素促進心肌細(xì)胞CSE表達和H2S生成的分子機制。
　　 主要研究內(nèi)容與結(jié)果如下:
　　 第一部分CSE參與了雌激素抗心肌氧化應(yīng)

3、激損傷的作用
　　 為明確內(nèi)源性H2S在雌激素抗心肌氧化應(yīng)激損傷過程中的作用，我們采用200μM過氧化氫(H2O2)處理后，新生大鼠心肌細(xì)胞釋放乳酸脫氫酶(LDH)和活化caspase3表達顯著增多，同時細(xì)胞活力和磷酸化Akt表達受到顯著抑制，說明H2O2對心肌細(xì)胞造成了氧化應(yīng)激損傷。而雌激素處理則可顯著抑制H2O2所導(dǎo)致的心肌細(xì)胞損傷。進一步研究發(fā)現(xiàn)，采用CSE阻斷劑PAG處理以及siRNA特異性敲低內(nèi)源性CSE表達后，雌激素

4、上述抗心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的作用被阻斷。上述結(jié)果提示:內(nèi)源性H2S參與了雌激素抗心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的作用。
　　 第二部分雌激素對心肌細(xì)胞中CSE表達以及內(nèi)源性H2S生成的影響
　　 在體外分離培養(yǎng)新生SD大鼠心肌細(xì)胞中加入雌激素(10-10-10-7mol/L)，通過realtime PCR和western blot法檢測雌激素對心肌細(xì)胞中CSE mRNA和蛋白表達的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)雌激素能夠劑量依賴性地促進心肌細(xì)胞中

5、CSE mRNA和蛋白的表達，10nM雌激素能使CSE蛋白表達上調(diào)3倍左右。
　　 用雌激素(10-8 mol/L)處理心肌細(xì)胞24h后發(fā)現(xiàn):雌激素可以顯著提高心肌細(xì)胞中H2S的生成率。
　　 第三部分雌激素調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞中CSE表達的受體機制
　　 在體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，雌激素受體（estrogen receptor, ER）非特異性受體阻斷劑ICI182，780以及ERα特異性阻斷劑MPP(Methyl-P

6、henol-Pyrazole)可以完全阻斷雌激素上調(diào)CSE表達的效應(yīng)，而ERβ特異性阻斷THC(Tereahydro-Chrysenediol)對雌激素上調(diào)CSE表達的作用無顯著影響。用特異性針對ERα的小干擾RNA（small interferingRNA，siRNA）片段敲低內(nèi)源性ERα表達后，也可以完全阻斷雌激素上調(diào)CSE表達的的作用。上述結(jié)果提示:ERα介導(dǎo)了雌激素上調(diào)CSE表達的作用。
　　 第四部分轉(zhuǎn)錄因子SP1在雌

7、激素上調(diào)CSE表達過程中的關(guān)鍵作用
　　 在體外培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞中，我們發(fā)現(xiàn)雌激素(10-10-10-7mol/L)可以劑量依賴性地上調(diào)SP1 mRNA和蛋白表達。用siRNA敲低內(nèi)源性SP1表達后，CSE的基礎(chǔ)表達顯著受抑，同時雌激素上調(diào)CSE表達的效應(yīng)被完全阻斷。將含有SP1結(jié)合位點的PGL3-CSE啟動子熒光素酶報告基因（PGL3-CSE）轉(zhuǎn)染到大鼠心肌細(xì)胞系H9C2細(xì)胞后發(fā)現(xiàn):轉(zhuǎn)染該質(zhì)粒后熒光素酶表達量明顯增加，雌

8、激素可以顯著誘導(dǎo)PGL3-CSE啟動子轉(zhuǎn)錄激活。為了探討SP1結(jié)合位點是否參與了CSE的基礎(chǔ)表達和雌激素誘導(dǎo)的CSE表達作用，我們構(gòu)建了SP1位點突變的PGL3-CSE啟動子表達質(zhì)粒PGL3-CSEmutant。進一步研究發(fā)現(xiàn):轉(zhuǎn)染了SP1結(jié)合位點突變的PGL3-CSE mutant報告基因后，H9C2細(xì)胞的基礎(chǔ)熒光素酶活性顯著低于轉(zhuǎn)染野生型CSE啟動子報告基因的細(xì)胞，此外雌激素對PGL3-CSE mutant報告基因的轉(zhuǎn)錄激活沒有顯著

9、影響。上述結(jié)果提示SP1在雌激素誘導(dǎo)CSE表達過程中起了關(guān)鍵作用。
　　 第五部分雌激素通過抑制miR22表達從而上調(diào)SP1表達
　　 已有研究發(fā)現(xiàn)miR-22參與SP1的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。我們用雌激素(10-10-10-7mol/L)處理心肌細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，雌激素可以劑量依賴性抑制miR-22表達。抑制miR-22表達可以促進SP1 mRNA和蛋白表達水平，而miR-22類似物不僅可以抑制SP1的基礎(chǔ)表達，同時可以阻斷雌激素上調(diào)SP

10、1表達的作用。提示:雌激素通過抑制miR-22表達從而上調(diào)SP1表達。
　　 第六部分雌激素通過抑制miR-22表達從而促進ERα表達
　　 對乳腺癌的研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miR-22可以調(diào)節(jié)ERα的表達。我們采用雌激素以及miR-22類似物處理心肌細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，雌激素可以上調(diào)ER的表達，而miR-22類似物不僅可以抑制ERα的基礎(chǔ)表達，同時可以阻斷雌激素上調(diào)ERα表達的作用。提示:雌激素通過抑制miR-22表達從而上調(diào)ERα表達

11、。
　　 第七部分雌激素替代可以顯著促進去卵巢大鼠心肌組織中CSE、SP1表達，抑制miR-22表達
　　 將雌性SD大鼠隨機分為三組:對照組(Sham)，去卵巢組(Ovx)和去卵巢+雌激素替代組(Ovx+E2)。Ovx+E2組給予雌二醇30μg/kg皮下注射，其余兩組給予溶劑，兩周后取左心室組織，檢測CSE、SP1以及miR-22的表達的影響。研究發(fā)現(xiàn)去卵巢后心肌組織中CSE、SP1的表達顯著下調(diào)，miR-22的表達顯

12、著上調(diào)，而雌激素替代后，CSE、SP1以及miR-22的表達恢復(fù)至假手術(shù)水平。由此說明雌激素替代可以顯著促進去卵巢大鼠心肌組織中CSE、SP1表達，抑制miR-22表達。
　　 四、結(jié)論:
　　 本研究表明，內(nèi)源性CSE/H2S增多在雌激素抗心肌細(xì)胞氧化損傷的過程中發(fā)揮重要作用。雌激素可以上調(diào)心肌細(xì)胞中CSE的表達，從而促進內(nèi)源性H2S生成。雌激素誘導(dǎo)CSE表達的作用機制與其抑制miR-22表達，從而促進SP1和ERα表