TRAIL、DR5及NF-κB p65在人難愈合創(chuàng)面肉芽組織和增生性瘢痕中的表達(dá)及其意義研究.pdf

1、研究背景： 瘢痕是各種創(chuàng)傷組織修復(fù)愈合的必然結(jié)果。它主要發(fā)生在創(chuàng)傷、感染、手術(shù)和燒傷等創(chuàng)面中。增生性瘢痕(hypertrophicscar，HS)是最常見的病理性瘢痕(PathologicScar)，其是以成纖維細(xì)胞的過度增生和細(xì)胞外基質(zhì)成分的過度聚集為主要特征，臨床上其雖然僅局限在原傷口范圍內(nèi)生長，但其發(fā)病機(jī)制至今尚不確切。其臨床表現(xiàn)為局部疼痛、瘙癢、突出于皮膚表面的增生腫塊，并伴有不同程度的功能障礙，危害人們的身心健康，在預(yù)

2、防及治療上尚無特效方法，是目前整形外科研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)問題之一。 細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖都是生命的基本現(xiàn)象，是維持體內(nèi)細(xì)胞數(shù)量動(dòng)態(tài)平衡的基本措施。細(xì)胞凋亡(apoptosis)，又稱為程序性細(xì)胞死亡(programmed cell death，PCD)，是有別于細(xì)胞壞死而受基因控制的一種主動(dòng)性細(xì)胞自殺過程。腫瘤壞死因子凋亡配體[Tumor necrosis factor(TNF)-related apoptosis-inducing

3、 ligand，TRAIL]廣泛地存在于人體各個(gè)組織和器官，能定向地導(dǎo)致異常細(xì)胞的凋亡，而不會影響正常細(xì)胞的生長分化。在增生性瘢痕中TRAIL的死亡受體5(DeathReceptor 5，DR5)起著重要的促凋亡作用[1]。越來越多的研究表明許多疾病的發(fā)生、發(fā)展都與TRAIL的凋亡抑制有關(guān)，以TRAIL作為靶點(diǎn)治療或緩解疾病已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)，并已應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)中。 核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)是

4、一種具有多向性調(diào)節(jié)作用的轉(zhuǎn)錄因子，對細(xì)胞內(nèi)許多基因的表達(dá)起著關(guān)鍵性的調(diào)控作用，參與細(xì)胞的生長、發(fā)育、凋亡等多種生理功能，并在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化、纖維化等方面起重要作用。越來越多的研究表明許多疾病的發(fā)生和發(fā)展都與NF-κB的過度活化有關(guān)。NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路也貫穿于創(chuàng)傷修復(fù)與愈合的整個(gè)生物學(xué)過程。研究表明，NF-κBp65是NF-κB信號傳導(dǎo)通路的關(guān)鍵基因。 目前，有關(guān)TRAIL及其DR5和NF-κBp65在難愈合創(chuàng)面肉芽組織及增生性

5、瘢痕中表達(dá)狀況如何、它們之間的聯(lián)系如何等問題國內(nèi)外尚未見報(bào)道。本研究擬以人難愈合創(chuàng)面肉芽組織、不同時(shí)間范圍階段的增生性瘢痕為研究對象，以正常皮膚為對照，采用免疫組化、RT-PCR和Westernblot技術(shù)檢測TRAIL及其死亡受體DR5和NF-κB在難愈合創(chuàng)面肉芽組織和增生性瘢痕各階段中的表達(dá)，并探討其之間的聯(lián)系，以進(jìn)一步探討瘢痕增生的機(jī)理，為臨床治療增生性瘢痕提供新的研究方向和思路。 目的： 本研究擬觀察TRAIL信

6、號傳導(dǎo)通路中凋亡因子TRAIL及其凋亡受體DR5和NF-κB信號傳導(dǎo)通路關(guān)鍵基因p65在人難愈合創(chuàng)面肉芽組織、不同時(shí)間階段的增生性瘢痕以及正常皮膚標(biāo)本的表達(dá)水平是否存在差異及TRAIL、DR5和NF-κBp65之間的聯(lián)系。 方法： 收集臨床標(biāo)本40例為實(shí)驗(yàn)組，其中難愈性創(chuàng)面難愈合創(chuàng)面肉芽組織(A組)、半年內(nèi)增生性瘢痕(B組)、半年至一年增生性瘢痕(C組)、一年以上增生性瘢痕(D組)組織各10例，收集正常皮膚組織標(biāo)本8例為

7、對照組(E組)。采用組織免疫化學(xué)方法分析各標(biāo)本中TRAIL、NF-κBp65表達(dá)；提取RNA以及核蛋白，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測組織中TRAIL、DR5及NF-κBp65mRNA表達(dá)水平：利用Westernblot技術(shù)檢測TRAIL以及NF-κBp65的蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果： 1.病理切片HE染色各組組織均為相應(yīng)的病理表現(xiàn)。A組中可見大量內(nèi)皮細(xì)胞和毛細(xì)血管，以及許多新生的圓形纖維母細(xì)胞，膠原纖維形成少，有炎性細(xì)胞浸潤

8、。B組到D組中纖維母細(xì)胞逐漸減少，形態(tài)由扁圓形逐漸變?yōu)榧?xì)長，炎性細(xì)胞和毛細(xì)血管逐漸減少至消失，皮下膠原纖維由粗大、紊亂逐漸變細(xì)、排列逐漸變規(guī)則，表皮較正常皮膚薄，無腳突和皮膚附屬器。E組表皮層次清楚，角化層角化明顯，皮膚附屬器豐富，膠原纖維束排列規(guī)則，少而疏松、細(xì)胞較少。 2.免疫組化SP法染色TRAIL在A組、B組成纖維細(xì)胞細(xì)胞漿中表達(dá)強(qiáng)陽性，C組、D組陽性表達(dá)逐漸減弱，接近E組；A組和B組表達(dá)明顯強(qiáng)于C組、D組和E組；NF-

9、κBp65主要表達(dá)部位為基底細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的細(xì)胞漿和細(xì)胞核內(nèi)，A組內(nèi)表達(dá)與E組接近，在增生性瘢痕各階段(B、C、D組)中表達(dá)陽性，尤其是在B組中皮膚基底細(xì)胞層細(xì)胞陽性表達(dá)尤為明顯。 3.RT-PCR檢測TRAILmRNA表達(dá)水平在A組和B組呈較高水平，明顯均高于其它各組(p<0.05)，而A組與B組之間差異無顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)，C組、D組與E組各組間比較，其差異也均無顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。 D

10、R5mRNA表達(dá)水平在A組中最高，明顯高于各組(p<0.05)，B、C、D組表達(dá)水平均低于E組，其差異均有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，但B、C、D組之間比較，其差異均無顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。 NF-κBp65mRNA表達(dá)水平各組間比較，其差異均無顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。但從各組均數(shù)來看，E組和A組處于較低水平(A組為0.38，E組為0.30)，B、C、D組處于較高水平(B組為0.44，C組為0.46，

11、D組為0.47)，數(shù)值相近，并且有高于E組和A組的趨勢。 在TRAIL與DR5線性相關(guān)分析中，Pearson相關(guān)系數(shù)為0.291，P=0.045<0.05，說明TRAIL與DR5存在正相關(guān)。 在NF-κBp65與TRAIL線性相關(guān)分析中，NF-κBp65與TRAIL的Pearson相關(guān)系數(shù)為0.371，P=0.009<0.05，說明NF-κBp65與TRAIL存在正相關(guān)。 在NF-κBp65與DR5線性相關(guān)分析中

12、，Pearson相關(guān)系數(shù)為-0.088，P=0.554>0.05，說明NF-κBp65與DR5相關(guān)性無顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 4.Westernblot檢測TRAIL在A組和B組中蛋白表達(dá)水平較高，在C組、D組、E組蛋白表達(dá)水平基本接近，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，A組和B組蛋白表達(dá)水平明顯高于其它各組(p<0.05)，而A組與B組之間差異無顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。 NF-κBp65在A組和E組中蛋白表達(dá)水平差異沒有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)

13、意義(p>0.05)，B組、C組、D組的蛋白表達(dá)水平明顯要高于A組和E組(p<0.05)。 結(jié)論： 1.在難愈合創(chuàng)面肉芽組織中TRAIL和死亡受體DR5表達(dá)水平明顯增高，NF-κBp65表達(dá)水平較低，表明難愈合創(chuàng)面肉芽組織中細(xì)胞凋亡增強(qiáng)，抗凋亡水平受到抑制，組織難以愈合。 2.在增生性瘢痕早期(半年內(nèi))中，TRAIL的表達(dá)仍然較高，但其死亡受體DR5的凋亡水平明顯低于正常，NF-κBp65的表達(dá)明顯增強(qiáng)，表明在增

14、生性瘢痕早期瘢痕組織凋亡作用降低，抗凋亡作用明顯增強(qiáng)，瘢痕組織表現(xiàn)出明顯的增生作用。NF-κBp65皮膚基底細(xì)胞層細(xì)胞陽性表達(dá)尤為明顯，表明NF-κBp65可能在增生性瘢痕增生中發(fā)揮著重要作用，對增生性瘢痕凋亡有著強(qiáng)有力的抑制作用，促進(jìn)了增生性瘢痕增生。 3.在增生性瘢痕后期(半年-1年)，TRAIL及其死亡受體DR5的表達(dá)均處于較低水平，NF-κBp65的表達(dá)仍高于正常皮膚，表明在增生性瘢痕后期細(xì)胞凋亡水平較低，抗凋亡水平較高

15、，仍有組織增生。 4.在增生性瘢痕成熟期(1年后)，TRAIL和NF-κBp65表達(dá)水平接近正常皮膚。瘢痕組織凋亡作用增強(qiáng)，增生減弱，變得平坦和消退。 5.NF-κBp65與TRAIL存在正相關(guān)，表明了TRAIL與NF-κBp65表達(dá)水平變化趨勢是同向的，在一定程度上反映了TRAIL表達(dá)與NF-κBp65表達(dá)相互影響和作用。TRAIL與DR5存在正相關(guān)，表明TRAIL與其受體DR5表達(dá)水平的變化趨勢是同向的，在一定程度上

16、反映了組織細(xì)胞對TRAIL誘導(dǎo)凋亡的敏感性。 意義： 本研究率先檢測了TRAIL、死亡受體DR5和NF-κBp65在難愈合創(chuàng)面肉芽組織及增生性瘢痕中不同增生階段的表達(dá)，提示了TRAIL凋亡途徑和NF-κBp65凋亡調(diào)控極有可能參與難愈合創(chuàng)面肉芽組織和增生性瘢痕的異常凋亡過程，對進(jìn)一步認(rèn)識難愈合創(chuàng)面肉芽組織的修復(fù)和瘢痕增生的機(jī)制及其防治具有一定意義，為我們在臨床上開展難愈性肉芽創(chuàng)面治療和瘢痕增生防治提供新的研究方向和思路。