內(nèi)毒素誘導(dǎo)急性肺損傷中熱休克蛋白的表達(dá)及大黃對HSP70表達(dá)的調(diào)控.pdf

1、急性呼吸窘迫綜合癥（ARDS）是臨床常見的危急重癥，其病理特征是中性粒細(xì)胞在肺內(nèi)聚集、血管內(nèi)凝血、肺毛細(xì)血管通透性增加致肺水腫，從而導(dǎo)致低氧血癥甚至死亡。
　　 熱休克蛋白（heat shock protein.HSP）是一種應(yīng)激蛋白（sress protein.SP），同時它也是一種內(nèi)源性的保護物質(zhì)，其中HSP70為最保守、最主要的一類，在大多數(shù)生物中含量最多，在細(xì)胞應(yīng)激后生成最為顯著。另外，研究表明大黃對LPS誘導(dǎo)的ALI具

2、有保護作用，可以抑制一氧化氮生成和iNOS活性，并且可以降低PLA2（磷脂酶A2）和血小板活化因子（PAF）的活性，從而起到保護肺臟，減輕肺損傷LPS誘導(dǎo)的ALI的作用。
　　 大黃對肺臟的保護作用是否與HSP家族成員有關(guān)，即大黃是否通過誘導(dǎo)肺內(nèi)HSP70的表達(dá)水平來保護肺組織，目前國內(nèi)外尚未見報道，而且HSP70表達(dá)水平在LPS誘導(dǎo)的ALI的動物模型中的時間規(guī)律性尚且不清。本實驗應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)和蛋白印跡試驗等技術(shù)進行

3、研究大黃，并對大黃預(yù)防組和大黃治療組LPS誘導(dǎo)的肺損傷組織中HSP70的表達(dá)部位及表達(dá)水平進行對比，從而證實大黃對LPS誘導(dǎo)的ALI的保護機制可能與HSP70有關(guān)，并為臨床上應(yīng)用大黃治療急性肺損傷提供理論依據(jù)。
　　 材料和方法：
　　 動物模型的建立及分組：健康wistar大鼠60只，隨機分成對照組、ALI組、大黃預(yù)防組、大黃治療組4組，每組15只。麻醉后，頸內(nèi)靜脈給0.9％生理鹽水或給LPS，于不同時間，腹主動脈取血

4、做血氣分析，后脫頸椎處死動物，并取雙側(cè)肺臟標(biāo)本，進行肺系數(shù)測定，而后進行HE染色及免疫組織化學(xué)染色（SP 法）以及Western-Blotting測定蛋白表達(dá)水平。
　　 結(jié)果判定：免疫組織化學(xué)陽性物質(zhì)表達(dá)在胞漿或胞核中，陽性判定應(yīng)用陽性細(xì)胞計數(shù)：顯微鏡×400倍率下每張切片中隨機選擇10個高倍視野，計算其中陽性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，求出百分比。蛋白印跡結(jié)果進行條帶灰度測定。陽性細(xì)胞百分比、蛋白印跡灰度值、血氣分析結(jié)果和肺系數(shù)等數(shù)據(jù)

5、資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x士s）表示，組內(nèi)不同時間比較均采用t檢驗。
　　 實驗結(jié)果：
　　 1、血氣分析（PO2）
　　 對照組各時間段無明顯差異，LPS組較對照組下降，以1h、2h為明顯。預(yù)防用藥組對LPS誘導(dǎo)的肺損傷大鼠的PO2改善較明顯。
　　 2、肺系數(shù)
　　 損傷組大鼠肺系數(shù)增高，與對照組存在顯著性差異，預(yù)防用藥組和治療用藥組肺系數(shù)低于損傷組，存在顯著性差異。
　　 3、大體標(biāo)本

6、和HE染色結(jié)果
　　 LPS組肺組織可見斑片狀壞死，整個肺充血、肺間質(zhì)水腫，肺泡間隔增寬，肺泡腔內(nèi)彌漫性出血及散在支氣管內(nèi)出血，預(yù)防用藥及治療用藥組肺表面充血有明顯減輕，斑片狀壞死消失，以預(yù)防用藥組為明顯。LPS組肺泡腔內(nèi)可見大量紅細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤，血管及支氣管周圍組織疏松水腫，有較多炎細(xì)胞浸潤，以中性粒細(xì)胞為主，晚期可見散在透明膜形成。預(yù)防用藥組和治療用藥組肺臟的組織病理學(xué)有明顯改善，但仍可見較明顯的炎細(xì)胞浸潤。
　

7、　 4、HSP70免疫組織化學(xué)染色結(jié)果
　　 正常組HSP70主要分布于支氣管及細(xì)支氣管上皮細(xì)胞，肺泡細(xì)胞和巨噬細(xì)胞可見散在陽性著色。LPS組表達(dá)增多，可見散在巨噬細(xì)胞和浸潤的中性粒細(xì)胞陽性著色，肺泡上皮細(xì)胞陽性數(shù)輕度增加，陽性細(xì)胞率與對照組相比存在顯著性差異。預(yù)防用藥組與治療用藥組陽性細(xì)胞數(shù)增加。
　　 5、蛋白質(zhì)印跡分析（western-bloting方法）
　　 HSP70條帶位于70KD附近，HSP70

8、蛋白量顯示，預(yù)防用藥組和治療用藥組表達(dá)量較對照組和LPS組加深、加寬。并且預(yù)防用藥組與治療用藥組之間存在顯著性差異（P<0.01）。
　　 討論：
　　 急性肺損傷病理特征是中性粒細(xì)胞在肺內(nèi)聚集，血管內(nèi)凝血，肺毛細(xì)血管通透性增加致肺水腫，從而導(dǎo)致低氧血癥。LPS還可以增加由其介導(dǎo)的各種生物活性因子的生物效應(yīng)，加重肺臟損傷和臨床癥狀。熱休克蛋白可以提高細(xì)胞的應(yīng)激能力，抵御各種損害因素的影響，起到保護細(xì)胞的作用，從而降低動物

9、的死亡率。本實驗研究中預(yù)防用藥組HSP70表達(dá)增加，免疫組織化學(xué)陽性細(xì)胞率和Western結(jié)果均高于急性肺損傷組，而且大鼠動脈血氧分壓增高、肺系數(shù)降低、肺組織損傷的病理學(xué)改變較輕，治療用藥組雖有一定程度的改善，但在動脈血氧分壓增高、肺系數(shù)降低、肺組織損傷的病理學(xué)改變和HSP70表達(dá)量上較預(yù)防用藥組差。揭示細(xì)胞經(jīng)大黃預(yù)處理后細(xì)胞中HSP70合成增加，同時也表明了大黃可能通過誘導(dǎo)HSP70的表達(dá)增加來保護損傷的肺組織。本研究的實驗結(jié)果對臨床

10、上應(yīng)用大黃注射液的治療的時間上具有指導(dǎo)性意義。
　　 結(jié)論
　　 本實驗研究表明，LPS組肺臟損傷較明顯，在預(yù)防用藥組可見明顯的肺臟功能的改善，治療用藥組也可見HSP70表達(dá)較LPS組增高，并且HSP70在支氣管、細(xì)支氣管粘膜上皮和血管內(nèi)皮均有強陽性表達(dá)，說明了HSP70很可能參與了降低血管通透性和保證氣管的正常通氣。本實驗的研究結(jié)果表明在注射LPS之前預(yù)先給予大黃注射液可以增加肺組織中HSP70的表達(dá)量，具有明顯的肺臟