神經(jīng)酰胺AD2646抑制人肺腺癌細(xì)胞A549生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分神經(jīng)酞胺AD2646對(duì)人肺腺癌細(xì)胞A549體外生長(zhǎng)的抑制作用和機(jī)理探討 目的：探討神經(jīng)酰胺 AD2646 對(duì)人肺腺癌細(xì)胞 A549 體外生長(zhǎng)的抑制作用和機(jī)理。 方法：神經(jīng)酰胺AD2646作用于人肺腺癌細(xì)胞A 549后，MTT法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，熒光分析檢測(cè)Caspase-3活性，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期，調(diào)亡細(xì)胞DNA電泳進(jìn)行凋亡分析。薄層層析色譜分析(TLC)檢測(cè)細(xì)胞葡糖苷鞘氨醇合成酶 (GC)鞘磷脂合成酶 (S

2、M)水平，高效液相色譜分析 (HPLC)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)酰胺水平。 結(jié)果：本研究通過(guò) MTT 法繪制神經(jīng)酰胺 AD2646 作用于 A549 細(xì)胞后的生長(zhǎng)曲線，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)酰胺．AD2646 處理組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線較對(duì)照組出現(xiàn)了明顯的下移；劑量越大，細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線下移更為明顯；處理組細(xì)胞24h后即出現(xiàn)生長(zhǎng)不良，72h后細(xì)胞稀疏，呈散在分布。 熒光分析發(fā)現(xiàn)AD2646對(duì)A549細(xì)胞Caspase-3活性有明顯影響。但CaspaSe

3、-3活性增加主要表現(xiàn)在藥物處理的早期，而且在觀察時(shí)段內(nèi)給藥量與最終細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的強(qiáng)度及Caspase-3活性水平并不一致。 FCM 細(xì)胞凋亡分析及 DNA 電泳細(xì)胞調(diào)亡分析均表明，神經(jīng)酰胺AD2646在體外抑制A549細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中有凋亡現(xiàn)象發(fā)生，F(xiàn)CM分析還顯示，在一定的時(shí)間與劑量范圍內(nèi)，AD2646 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，一定程度上還呈現(xiàn)劑量依從性。 TLC法發(fā)現(xiàn)外源性神經(jīng)酰胺AD2646在加量的早期即對(duì)A549細(xì)胞GC/SM活性有

4、抑制作用，其中對(duì)GC的抑制作用比對(duì)SM的抑制作用更強(qiáng)，在加入神經(jīng)酰胺AD2646作用后，20min即達(dá)到高峰，并在以后維持較高水平。高效液相色譜分析顯示細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)酰胺水平在加藥早期即明顯地迅速提高，30min～40min即達(dá)高峰，以后維持在一較高水平。 結(jié)論： ①神經(jīng)酰胺作為脂質(zhì)第二信使，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化以及凋亡；其類似物AD2646可抑制肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549的生長(zhǎng)，抑制效應(yīng)具有劑量與時(shí)間雙重依從性；同時(shí)能誘導(dǎo)A5

5、49細(xì)胞凋亡，凋亡效應(yīng)在一定程度上呈現(xiàn)劑量依從性。 ② Caspase-3雖參與了AD2646誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡，但可能還有其他效應(yīng)路徑參與了AD2646誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡。 ③外源性的神經(jīng)酰胺AD2646在作用于A549細(xì)胞后，加量的早期對(duì)A549細(xì)胞GC/SM活性即有抑制作用，其中對(duì)GC的抑制作用比對(duì)SM的抑制作用更強(qiáng)。 ④細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)酰胺水平在加藥早期即顯著地迅速提高，30min～40min即達(dá)高峰，

6、以后維持較高水平而無(wú)明顯進(jìn)一步升高。 ⑤ A549細(xì)胞的GC/SM活性受抑情況，胞內(nèi)神經(jīng)酰胺濃度的變化，與Caspase-3活性的早期檢測(cè)結(jié)果并不平行，提示AD2646誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡，除了Caspase蛋白酶家族，還應(yīng)有其它的效應(yīng)信號(hào)路徑參與。 第二部分神經(jīng)酰胺AD2646對(duì)人肺腺癌細(xì)胞A549移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用觀察 目的：評(píng)價(jià)神經(jīng)酰胺類似物AD2646對(duì)人肺腺癌A549裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響，為進(jìn)一步應(yīng)用

7、于肺癌臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：建立裸鼠皮下移植瘤模型，將其隨機(jī)分為三組，①神經(jīng)酰胺AD2646治療組：10mg/kg腹腔注射，接種后第一天開(kāi)始，每間隔2天給藥1次，共給藥14次；②生理鹽水對(duì)照組：注射NS，注射容積量及方法同第一組；③10％CE對(duì)照組：注射容積量及方法同第一組。觀察移植瘤大小，末次給藥24h后，脫頸椎處死裸鼠，解剖摘除皮下移植瘤，進(jìn)行觀察，并對(duì)裸鼠進(jìn)一步行血液學(xué)、血清酶學(xué)、臟器病理學(xué)、腫瘤病理學(xué)觀察；流式細(xì)

8、胞儀術(shù)及TUNEL法檢測(cè)移植瘤細(xì)胞凋亡，RT-PCR及Western blot檢測(cè)移植瘤細(xì)胞中Caspase-3 mRNA及蛋白表達(dá)。 結(jié)果：2周后，AD2646組與CE組及NS組移植瘤大小比較無(wú)明顯差異；2周后～3周時(shí)，AD2646處理組瘤體顯著小于NS組(P<0.01)； 但CE組也小于NS組(P<0.01)。AD2646組瘤體重量與CE組及NS組比較，P<0.01，有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；CE組及NS組無(wú)并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

9、。肉眼及光鏡下觀察，各組裸鼠的心、肝、肺、腎等臟器均未見(jiàn)明顯病理學(xué)改變。AD2646 處理組WBC計(jì)數(shù)與NS組、CE組比較有明顯差異(P<0.01)，低于正常；而各組的紅細(xì)胞、血小板計(jì)數(shù)均正常，各組間兩兩比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。觀察各組之間血清生化指標(biāo)沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。NS及CE組鏡下主要表現(xiàn)為中分化腺癌的特點(diǎn)，瘤細(xì)胞呈浸潤(rùn)生長(zhǎng)，壞死較少。AD2646處理組瘤組織中細(xì)胞數(shù)減少，較多的壞死灶，細(xì)胞核溶解，碎裂少。AD2646處理組G1期細(xì)胞較對(duì)

10、照組為低，而G2+M期細(xì)胞比例則較高，兩者均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P<0.05。流式細(xì)胞術(shù)分析，AD2646處理組細(xì)胞凋亡率為9.61％，是對(duì)照組的3-4倍。TUNEL檢測(cè)移植瘤細(xì)胞凋亡，計(jì)數(shù) 5 個(gè)高倍視野的陽(yáng)性細(xì)胞，亦較對(duì)照組，明顯較高；AD2646 處理組 Caspase-3 mRNA 及蛋白表達(dá)也明顯高于NS與CE組。 結(jié)論：神經(jīng)酰胺類似物AD2646可抑制人肺腺癌A549裸鼠移植瘤生長(zhǎng)，誘導(dǎo)移植瘤細(xì)胞凋亡，增加移植瘤中Caspa