辛伐他汀調(diào)控脂多糖對大鼠心肌成纖維細(xì)胞AT2R蛋白表達(dá)和凋亡作用的研究.pdf

1、現(xiàn)已證實(shí)，心肌纖維化是各種心血管疾病發(fā)展到一定階段的病理結(jié)果，各種刺激（如高血壓、炎癥等）因素?fù)p傷心肌，引起纖維組織增生，代替了正常的心肌組織，導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)重構(gòu)。心肌細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）在維持心臟正常的結(jié)構(gòu)和功能及細(xì)胞生長分化過程中起非常重要的作用。ECM由膠原、彈性蛋白、纖粘蛋白等組成，其中最主要的成分是膠原。而膠原是由心肌成纖維細(xì)胞（CFs）產(chǎn)生和分泌的，CFs過度增殖和膠原合成功能增強(qiáng)，使膠原增生、ECM蛋白沉積，是導(dǎo)致心肌纖維化

2、、心臟間質(zhì)重構(gòu)的重要病理基礎(chǔ)。心肌組織高水平表達(dá)血管緊張素II（Ang II）受體的兩種主要表型Ang II 1型受體（AT1R）和2 型受體（AT2R）。大量研究表明，AT2R可拮抗AT1R的功能，抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞分化和凋亡。3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（HMG-CoA）還原酶抑制劑－他汀類藥物可不依賴于其調(diào)脂作用抑制CFs增殖和膠原合成，從而調(diào)節(jié)心肌纖維化的病理進(jìn)程。同時(shí)，他汀類藥物對多種細(xì)胞的凋亡均具有促進(jìn)作用。但目前尚無

3、研究表明他汀類藥物抑制心肌纖維化的作用是否涉及對CFs凋亡和AT2R表達(dá)的調(diào)控效應(yīng)。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號傳遞途徑在細(xì)胞的信號網(wǎng)絡(luò)中起著極為重要的作用，該家族中細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）信號傳遞途徑是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長發(fā)育及凋亡的的核心。脂多糖（LPS）是心肌纖維化的誘導(dǎo)因子，它還可通過誘導(dǎo)過量的NO生成而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。目前關(guān)于他汀類藥物調(diào)控大鼠CFs凋亡和AT2R表達(dá)的機(jī)制尚不清楚，是否與ERK信號傳導(dǎo)途徑有關(guān)，是值得探討

4、的問題。 本研究旨在觀察LPS對大鼠CFs NO和AT2R表達(dá)及CFs凋亡的影響；研究辛伐他?。⊿im）干預(yù)后大鼠CFs NO和AT2R表達(dá)的變化和對ERK1/2磷酸化的調(diào)控作用；闡明他汀類藥物在改善心肌纖維化中的作用及其機(jī)制。 本研究以胰酶消化、差速貼壁法培養(yǎng)的新生Sprague-Dawley（SD）大鼠CFs為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，采用硝酸還原酶法測定CFs的NO產(chǎn)量，用免疫印記法（Western blot）檢測CFs的AT2R

5、和ERK1/2蛋白表達(dá)，用Hoechst 33258染色檢測CFs凋亡率。 動(dòng)態(tài)觀察：（1）LPS對大鼠CFs的NO和AT2R蛋白表達(dá)的影響。（2）Sim對LPS介導(dǎo)大鼠CFs的NO和AT2R蛋白表達(dá)變化的影響。（3）LPS對大鼠CFs凋亡的影響及Sim的干預(yù)效應(yīng)。（4）LPS對大鼠CFs中ERK1/2磷酸化的影響及Sim的調(diào)控效應(yīng)。（5）AT2R在Sim對LPS介導(dǎo)的ERK1/2磷酸化水平改變及大鼠CFS凋亡率變化中的調(diào)控作用

6、。 研究結(jié)果表明：（1）0.1 μg/ml LPS作用24 h后，CFs的AT2R/β-actin值為0.18 ± 0.02，與對照組（0.18 ± 0.02）比較無顯著差異（P > 0.05）；1 μg/ml、10 μg/ml、100 μg/ml LPS干預(yù)組其值分別為0.14 ± 0.02、0.10 ± 0.01和0.15 ± 0.01，均顯著低于對照組（P < 0.05 ~ 0.01）。（2）0.1 μg/ml、1 μg/

7、ml、10 μg/ml和100 μg/ml LPS作用24 h后，CFs培養(yǎng)液中NO水平分別為35.51 ± 3.74 μM、49.72 ± 4.6 μM、59.25 ± 3.78 μM和76.45 ± 3.93 μM。除0.1 μg/ml LPS外，其余各LPS組的NO水平均高于對照組（33.83 ± 2.23 μM），統(tǒng)計(jì)學(xué)差異非常顯著（P < 0.01）。（3）在10 μg/ml LPS干預(yù)前30 min，用200 μM NO合成

8、酶抑制劑Nω-左旋精氨酸甲酯（L-NAME）預(yù)處理CFs，24 h后AT2R/β-actin值為0.17 ± 0.02，與10 μg/ml LPS單獨(dú)作用組相比顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.01），與空白對照組相比無顯著差異（P > 0.05）。L-NAME單獨(dú)作用組較之空白對照組AT2R的表達(dá)無顯著差異（P > 0.05）。（4）在0.01 μM和0.1 μM Sim與10 μg/ml LPS共同干預(yù)組，NO生成量分別為60

9、.19 ± 5.74 μM和55.89 ± 4.87 μM，與10 μg/ml LPS組（59.25 ± 3.77 μM）比較無顯著差異（P > 0.05）；在1 μM和10 μM Sim與10 μg/ml LPS共同干預(yù)組，NO生成量分別為48.97 ± 2.25 μM和42.24 ± 3.88 μM，顯著低于10 μg/ml LPS干預(yù)組（P < 0.01）。（5）在0.01 μM和0.1 μM Sim與LPS共同干預(yù)24 h后，A

10、T2R/β-actin值分別為0.10 ± 0.02和0.12± 0.02，與LPS對照組（0.10 ± 0.02）比較無顯著差異（P > 0.05）；在1 μM和10 μM Sim與LPS共同干預(yù)后，AT2R/β-actin值分別為0.15 ± 0.01和0.18 ± 0.02，與對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（分別P < 0.05和P < 0.01）。（6）Hoechst 33258染色顯示，在10 μM Sim與1 μg/ml LPS分別

11、干預(yù)24 h后，CFs凋亡率分別為（7.56±0.39）％、（9.23±0.86）％，與對照組（8.67±0.59）％相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P >0.05）。而在1 μg/ml LPS+10 μM Sim干預(yù)24 h后，CFs凋亡率為（29.56±2.53）％，與1 μg/ml LPS組與10 μM Sim組相比有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P < 0.05）。（7）1 μg/ml LPS分別與2 μM、5μM、10μM Sim共同干預(yù)24 h后，C

12、Fs凋亡率分別為（19.37 ± 1.79）％、（24.94 ± 2.21）％和（29.56±2.53）％，與1 μg/ml LPS單獨(dú)作用組相比，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異非常顯著（P<0.01）。在1 μg/ml LPS+10μM Sim+1mM甲羥戊酸（L-MVA）共同干預(yù)24 h后，CFs凋亡率為（13.06 ± 0.98）％，與1 μg/ml LPS+10 μM Sim作用組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。（8）在10 μM的Sim

13、干預(yù)4 h后，磷酸化的ERK1/2（p-ERK1/2）蛋白表達(dá)水平是對照組的（56 ± 5）％，與對照組相比，差異具有非常顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），1 μg/ml LPS干預(yù)4 h后， p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平是對照組的（97 ± 8）％，與對照組相比，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），1 μg/ml LPS與10 μM的Sim共同干預(yù)4 h后，p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平是對照組的（35 ± 3）％，與對照組相比，統(tǒng)計(jì)

14、學(xué)差異顯著（P<0.05）。1 μg/ml LPS+10 μM Sim+1 μM PD123319（特異性AT2R阻斷劑）干預(yù)后，p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平是對照組的（50 ± 6）％，與1 μg/ml LPS+10 μM Sim組相比，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著（P<0.05）。（9）在2 μM 和5 μM PD123319分別與1 μg/ml LPS+10 μM Sim共同作用24 h后，CFs凋亡率分別為(26.12 ± 2.10 )％和(

15、19.64 ± 2.06 )％，與1 μg/ml LPS+10 μM Sim組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在10 μM的PD123319+1 μg/ml LPS+10 μM Sim 24 h后，CFs凋亡率為( 15.64 ± 1.60 )％，與1 μg/ml LPS+10 μM Sim組相比，差異非常顯著(P<0.01)。而10 μM的PD123319單獨(dú)作用組CFs凋亡率為( 7.54 ± 0.70)％，與對照組比較，

16、差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0.05)。 上述研究結(jié)果提示：（1）LPS可通過誘導(dǎo)CFs內(nèi)NO生成，以濃度依賴性抑制AT2R蛋白表達(dá)，Sim可減少NO生成，拮抗LPS對AT2R蛋白表達(dá)的抑制效應(yīng)。（2）Sim可通過抑制L-MVA通路，使LPS作用下CFs的凋亡敏感性增加，該效應(yīng)具有濃度依賴性。（3）Sim可通過抑制ERK1/2 磷酸化，增加LPS介導(dǎo)的CFs凋亡。（4）Sim可通過上調(diào)AT2R蛋白的表達(dá)，抑制ERK1/2 磷酸化，