Ras相關Aurora kinases和Stanniocalcin2在卵巢癌發(fā)生和進展中的作用及機理研究.pdf

1、卵巢癌是婦科三大惡性腫瘤之一，卵巢惡性上皮性腫瘤死亡率居首，嚴重威脅著全球女性的健康。Ras是腫瘤中最常見的癌基因，70％以上的卵巢癌中可檢測到Ras蛋白過度表達。Ras可以激活許多下游信號通路，其中包括Aurora kinases家族和Stanniocalcin家族。
　　第一部分 Ras相關Aurora kinases和基因組不穩(wěn)定性相關腫瘤發(fā)生的機理研究
　　背景：極光激酶（Aurora kinases）是一個絲/蘇氨

2、酸蛋白激酶家族，位于Ras信號通路下游，與細胞有絲分裂相關，且在多種腫瘤中有高表達，是一種重要的癌基因。卵巢癌和胰腺癌中常同時存在極光激酶A/B(Aurora kinase A/B，AurA/B)的激活或乳腺癌易感蛋白1/2（Breast cancer susceptibility protein1/2，BRCA1/2）的失活。AurA/B和BRCA1/2之間的不平衡可能影響腫瘤細胞的增殖和腫瘤的發(fā)生，但是，這些分子之間的相互作用和調(diào)控

3、腫瘤發(fā)生的機制仍不清楚。
　　目的：研究AurA/B和BRCA1/2之間的相互調(diào)節(jié)對腫瘤發(fā)生的影響，為優(yōu)化AurA/B和BRCA1/2相關腫瘤的診斷和治療提供指導。
　　方法：卵巢癌細胞株OVCA433和在胰腺癌細胞株Capan-1中，用特定shRNA單獨或聯(lián)合沉默AurA/B或/和BRCA1/2，檢測所獲細胞株中AurA/B和BRCA1/2蛋白和mRNA的水平，并研究這些細胞的增殖能力、平板克隆形成能力、細胞周期分布及相關

4、蛋白的表達、胞質(zhì)分裂、細胞多核性、染色體四倍體性和裸鼠成瘤能力。
　　結果：在卵巢癌細胞系OVCA433中，AurA沉默增加BRCA1/2的表達，但對AurB的表達影響不明顯;干擾AurB的表達促進AurA和BRCA1/2的表達，同時沉默BRCA1/2明顯提高AurA的表達而不影響AurB。在BRCA2基因功能缺陷的胰腺癌細胞株Capan-1中，AurA和AurB的蛋白表達相互補充，AurA和AurB沉默后BRCA1的表達上調(diào)，B

5、RCA1沉默后AurA降低，AurB變化不明顯。在這兩株細胞中，同時沉默AurA和AurB明顯提高BRCA1/2的表達。單獨或聯(lián)合干擾AurA/B和/或BRCA1/2對其他基因的mRNA水平?jīng)]有影響。用MG132處理細胞后，AurA/B和BRCA1/2蛋白之間的相互影響消失。
　　干擾AurA和/或AurB的表達抑制細胞增殖、減少平板克隆形成數(shù)、抑制細胞周期進程，而干擾BRCA1和/或BRCA2促進細胞增殖、增加平板克隆形成數(shù)、促

6、進細胞周期進程，同時干擾AurA/B和BRCA1/2抵消AurA/B或BRCA1/2對細胞增殖、平板克隆形成能力和細胞周期的影響。
　　沉默AurA/B和/或BRCA1/2引起一系列周期蛋白變化，其中比較一致的是p53和cyclinA。沉默AurA和/或AurB增加p53蛋白的表達、減少cyclin A的表達，而沉默BRCA1和/或BRCA2降低p53水平、增加cyclinA水平，同時沉默AurA/B和BRCA1/2中和AurA/

7、B或BRCA1/2對p53和cyclin A的影響。
　　相比于對照組，低表達AurA和/或AurB的細胞系細胞多核性和染色體四倍體性降低，而低表達BRCA1和/或BRCA2細胞多核性和染色體四倍體性提高，AurA/B和BRCA1/2同時低表達的細胞系中細胞多核性和染色體四倍體性與對照組細胞相當。在有絲分裂末期，兩種細胞中AurA/B和BRCA1/2均同時定位于中間體，但Capan-1細胞中BRCA1在中間體的累積不明顯。沉默Au

8、rA和/或AurB增加BRCA2在中間體上的表達，對BRCA1影響不明顯，沉默BRCA1和/或BRCA2增加AurA/B在中間體的累積。
　　在裸鼠成瘤實驗中，相比于對照組，低表達AurA和/或AurB的細胞系腫瘤生長慢，而低表達BRCA1和/或BRCA2的細胞系腫瘤生長快，同時低表達AurA/B和BRCA1/2的細胞系腫瘤生長快于AurA和/或AurB干擾組，而慢于BRCA1和/或BRCA2干擾組。
　　結論：AurA/B

9、和BRCA1/2之間相互負性調(diào)節(jié)，并反相影響細胞增殖、細胞周期進程、胞質(zhì)分裂、細胞多核性、四倍體性和腫瘤的發(fā)生。
　　第二部分 Ras下游Stanniocalcin2在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展中的作用及機理
　　背景：分泌型蛋白斯鈣素(Stanniocalc in，STC)在魚類中參與調(diào)節(jié)鈣磷平衡。人類STC包含STC1和STC2兩個成員，均和多種腫瘤有關。RAS轉化的卵巢癌細胞中STC1水平升高，并促進腫瘤的發(fā)生，但STC2在卵

10、巢癌中的作用還不清楚。
　　目的：研究STC2在卵巢癌發(fā)生中的作用及機制，為卵巢癌的診斷及治療提供思路。
　　方法：首先在卵巢癌細胞系SKOV3中轉染HA-tag標記的STC2 cDNA，以證明分泌型蛋白STC2可以作用于自身細胞;然后在一系列卵巢癌細胞系中用STC2shRNA或cDNA沉默或過表達STC2，以系統(tǒng)研究STC2對卵巢癌細胞增殖、平板克隆、周期進程、對順鉑和紫杉醇的敏感性及細胞遷移和侵襲能力的影響;并構建動物模

11、型，以觀察STC2在體內(nèi)的作用;最后構建人高級別漿液性卵巢癌和正常卵巢的組織芯片，分析STC2與患者生存期的關系。
　　結果：STC2可以分泌至細胞外，再從胞外結合到細胞膜上。在Hey、 Hey A8、OVCA420、OVCA429細胞中，干擾STC2的表達抑制細胞增殖和平板克隆形成、促進G1-S周期阻滯、促進細胞對順鉑和紫杉醇的敏感性，促進細胞遷移和侵襲;相反，在A2780、SKOV3、SKOV3 ip1細胞中，過表達STC2促

12、進細胞增殖和平板克隆形成、促進G1-S周期過渡、抑制順鉑和紫杉醇引起的凋亡，抑制細胞遷移和侵襲。低表達STC2的細胞中細胞周期相關蛋白CDK2、CDK4、CDK6表達較對照組低，而促凋亡蛋白Bax、Bid和cytoC表達較高;抑存活并促轉移蛋白p38、pp38表達升高，STAT3表達升高或不變，pSTAT表達下調(diào);MEK、ERK1、pERK1/2蛋白的表達沒有明顯變化;過表達STC2的細胞中以上蛋白變化趨勢相反。在裸鼠皮下移植瘤實驗中，

13、干擾Hey細胞中的STC2抑制腫瘤生長，過表達SKOV3 ip1細胞中的STC2促進腫瘤生長;在裸鼠腹腔種植轉移模型中，低表達STC2促進腹腔種植轉移，而過表達STC2抑制腹腔轉移灶的形成。STC2在卵巢癌組織中高表達，而在正常卵巢組織中幾乎不表達。高表達STC2的患者有更長的無進展生存期和總生存期。
　　結論：STC2促進卵巢癌細胞增殖和耐藥并促進腫瘤生長，但抑制細胞遷移侵襲并抑制腹腔種植轉移，STC2高表達可能和卵巢癌患者較好