腸內(nèi)營養(yǎng)對應(yīng)用FK506肝移植大鼠PBMC細胞因子表達的影響.pdf

1、目的： 建立大鼠肝移植術(shù)后腸內(nèi)營養(yǎng)支持模型；調(diào)查腸內(nèi)營養(yǎng)和FK506在原位肝移植術(shù)后發(fā)生急性排斥反應(yīng)的大鼠中，其外周血單個核細胞(PBMC)細胞因子IL-2、IFN-γ、IL-10、TGF-βmRNA表達，探討肝移植后細胞因子譜的改變，以及腸內(nèi)營養(yǎng)與FK506對細胞因子譜的影響和相互間的關(guān)系。 方法： 1.大鼠原位肝移植(ROLT)模型的建立與穩(wěn)定 1)實驗動物 供體：清潔級Wistar大鼠，雌雄

2、不限，體重280～300g。 受體：清潔級SD大鼠，體重250～300g。 2)實驗用套管 門靜脈、肝下下腔靜脈套管：硬質(zhì)的聚乙烯管經(jīng)火焰軟化后拉制而成；膽管支撐管：硬膜外導(dǎo)管拉制而成。 3)手術(shù)過程 改良二套管法 供體手術(shù)：要點一縮短熱缺血時間，減少安置套管機械性損傷和操作難度供肝的修整及套管：要點-0-4℃的平衡液冰浴中進行 受體手術(shù)：要點-順序開放供、受體的肝下下腔靜脈，開放

3、前排除受體肝下下腔靜脈血栓 2.ROLT后急性排斥反應(yīng)的肝臟病理演變 確定Wistar→SD移植方向是否具有較高的免疫原性?供肝是否出現(xiàn)急性排斥反應(yīng)的病理損傷? 1)標本來源：Wistar→SD的原位肝移植大鼠模型，于術(shù)后d1、d2、d3、d5、d7、d8、d9、d11、d15、d21、d40、d60隨機處死大鼠，取移植肝臟組織。 2)病理切片制?。禾K木精-伊紅(HE)染色，倒置顯微鏡下觀察并照相取樣

4、 3)病理評價標準：1995年國際肝臟移植排異分級會議制定的標準 4)病理評分：病理特征評定，生成急性排斥活動指數(shù)RAI(RejectionActivityindex)，總分0～9分，繪制RAI-時間曲線圖。 3.腸內(nèi)營養(yǎng)支持模型的建立和隨機分組 1)腸內(nèi)營養(yǎng)制劑及免疫抑制劑： 安素(Ensure，EN)終濃度：2Kcal/mlFK506膠囊(FK)：1mg/粒，終濃度：0.266mg/ml

5、2)隨機分組： 對照組(control)、免疫抑制組(FK)、營養(yǎng)支持組(EN)、免疫抑制+營養(yǎng)支持組(FN) 4.安素和FK506對肝移植大鼠排斥反應(yīng)的影響 1)標本采?。盒g(shù)后7d脫頸處死，取外周血。 2)PBMCs分離：Ficoll密度梯度離心 3)細胞總RNA的提?。喝A舜公司“小量細胞總RNA快速抽提純化試劑盒”說明書程序 4)RNA的鑒定與定量 瓊脂糖凝膠電泳，檢測OD26

6、0、OD280，計算RNA濃度 5)RT-PCR檢測細胞因子mRNA表達 A、引物設(shè)計：根據(jù)基因庫中的序列，利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計基因?qū)Ｒ恍缘囊?B、逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測 QIAGEN公司的“OneStepRT-PCRKit”試劑盒說明書程序 結(jié)果： 1.50例大鼠肝移植模型穩(wěn)定存活。24小時存活率84.0％(42/50)；1周存活率82.0％(41/50)。

7、2.急性免疫排斥反應(yīng)術(shù)后1～5d處于上升期，5～7d達到高峰并維持至15d左右。 3.各組細胞因子mRNA的表達 1)IL-2:control、EN組間無差異；FK、FN二組顯著低于control組(p=0.003，p=0.001)。 2)IL-10:control、EN組間無差異，IL-10的表達均處于較高水平，與FK、FN組顯著差異(p＜0.01)；FN、FK組間顯著差異(p=0.013) 3)TGF

8、-β：control、EN組間無差異，F(xiàn)K、FN組間無差異。FK、FN組與control、EN組顯著差異(p＜0.01 4)IFN-γ：control、EN組間無統(tǒng)計差異。FN、FK組與control、EN組顯著差異(p＜0.01)；FN、FK組間顯著差異(p=0.013) 本文對二套管法作了相應(yīng)的改進，縮短了肝移植的手術(shù)時間，使操作更簡單，無須手術(shù)顯微鏡，術(shù)后成活率高。在此基礎(chǔ)上建立的Wistar→SD大鼠肝移植模型具

9、有較高的免疫原性，可在術(shù)后一周左右出現(xiàn)急性排斥反應(yīng)的高峰，可作為理想的觀察的節(jié)點。通過簡單的灌胃針，可以滿足大鼠術(shù)后用藥和腸內(nèi)營養(yǎng)支持的需要。術(shù)后一周檢測外周血單個核細胞Th1和Th2型細胞因子mRNA表達表明，肝移植后各細胞因子高表達，EN與對照組無差異。FK、FN組IL-2、IL-10、IFN-γ、大鼠肝移植后急性排斥反應(yīng)時，外周血單個核細胞高表達Th1、Th2型細胞因子，可能產(chǎn)生Th1/Th2平衡漂移導(dǎo)致免疫排斥。應(yīng)用FK506在