構(gòu)建M23-AQP4穩(wěn)定表達的HEK293細(xì)胞應(yīng)用于血清抗AQP4抗體檢測的研究.pdf

1、分類號：密級：UDC：學(xué)號：416522812054南昌大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文構(gòu)建構(gòu)建M23M23AQP4AQP4穩(wěn)定表達的穩(wěn)定表達的HEK293HEK293細(xì)胞應(yīng)用于血清抗細(xì)胞應(yīng)用于血清抗AQP4AQP4抗體檢測的研究抗體檢測的研究SerumantiAQP4antibodydetectionbasedonHEK293cellsstablyexpressM23AQP4符青青培養(yǎng)單位（院、系）：江西省人民醫(yī)院指導(dǎo)教師姓名、職稱：吳曉牧教授

2、主任醫(yī)師申請學(xué)位的學(xué)科門類：醫(yī)學(xué)學(xué)科專業(yè)名稱：神經(jīng)病學(xué)論文答辯日期：2015年6月3日答辯委員會主席：評閱人：2015年6月3日摘要II摘要目的目的：構(gòu)建M23AQP4穩(wěn)定表達HEK293細(xì)胞，并以此細(xì)胞為底物，采用細(xì)胞間接免疫熒光法（CBA）檢測血清標(biāo)本抗AQP4抗體。觀察不同溫度保存對M23AQP4穩(wěn)定表達HEK293細(xì)胞和血清標(biāo)本抗AQP4抗體的影響，探索一種簡便易行的血清抗AQP4抗體檢測方法，以利于血清抗AQP4抗體檢測的臨床

3、推廣。方法方法：將pEGFPN1M23AQP4質(zhì)粒通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板的HEK293細(xì)胞，在熒光顯微鏡下觀察并選擇瞬時轉(zhuǎn)染率高的細(xì)胞培養(yǎng)孔，用含G418的篩選培養(yǎng)液篩選并挑單克隆細(xì)胞進行培養(yǎng)擴增，獲得綠色熒光穩(wěn)定表達的單克隆細(xì)胞，并以此細(xì)胞為底物，采用CBA法檢測M23AQP4表達及分布，以鑒定獲得綠色熒光穩(wěn)定表達的單克隆細(xì)胞是否為M23AQP4穩(wěn)定表達細(xì)胞。經(jīng)鑒定M23AQP4穩(wěn)定表達HEK293細(xì)胞構(gòu)建成功后，

4、以其作為底物，采用CBA法檢測7例視神經(jīng)脊髓炎（NMO）、24例多發(fā)性硬化（MS）、41例其他脫髓鞘性疾病（視神經(jīng)炎、脊髓炎、脫髓鞘性腦病、吉蘭巴雷綜合征）以及30例非脫髓鞘性疾病患者血清抗AQP4抗體及其滴度，并比較4組患者血清抗AQP4抗體陽性率。M23AQP4穩(wěn)定表達HEK293細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板并經(jīng)4%多聚甲醛固定，于室溫、4℃、20℃4周保存，并分別作為底物再次檢測經(jīng)首次檢測為抗AQP4抗體陽性的血清標(biāo)本及隨機選取的相

5、等數(shù)量的陰性血清標(biāo)本的抗AQP4抗體及滴度，并比較其抗AQP4抗體陽性率和抗體滴度與首次檢測結(jié)果是否存在差異。經(jīng)首次檢測為抗AQP4抗體陽性的血清標(biāo)本及隨機選取的相等數(shù)量的抗AQP4抗體陰性血清標(biāo)本反復(fù)凍融3次后于室溫、4℃、20℃1周保存，以新鮮制備的M23AQP4穩(wěn)定表達HEK293細(xì)胞為底物，采用CBA法分別檢測上述血清標(biāo)本抗AQP4抗體及其滴度，并比較其檢測結(jié)果與首次檢測結(jié)果是否存在差異。結(jié)果結(jié)果：經(jīng)CBA法檢測鑒定表明綠色熒光