重慶低海拔蟲(chóng)草種及其活性物質(zhì)基礎(chǔ)研究.pdf

1、蟲(chóng)草為子囊菌亞門(mén)(Ascomycotina)核菌綱(Pyrenomycetes)球殼目(Sphaeriales)麥角菌(Clavicipitaceaes)蟲(chóng)草屬(Cordyceps)類(lèi)真菌寄生于昆蟲(chóng)體中，形成的菌蟲(chóng)復(fù)合體。至今，發(fā)現(xiàn)的蟲(chóng)草有400多種，我國(guó)報(bào)道的大約有100多種，其中，冬蟲(chóng)夏草為主要藥用品種，是一種名貴中藥材。近年來(lái)，隨著冬蟲(chóng)夏草需求量不斷增加，導(dǎo)致對(duì)野生冬蟲(chóng)夏草掠奪性挖掘，使天然冬蟲(chóng)夏草生態(tài)遭受?chē)?yán)重破壞，資源瀕臨絕跡。

2、因此，篩選評(píng)價(jià)新蟲(chóng)草資源，滿足市場(chǎng)需求已是當(dāng)務(wù)之急。我國(guó)蟲(chóng)草研究主要集中在高海拔地區(qū)種類(lèi)，低海拔地區(qū)蟲(chóng)草種類(lèi)研究較少。本文重點(diǎn)對(duì)重慶低海拔地區(qū)新發(fā)現(xiàn)的一種蟲(chóng)草的分類(lèi)學(xué)及其活性物質(zhì)進(jìn)行了系統(tǒng)研究，主要結(jié)果如下：
　　 1.重慶低海拔蟲(chóng)草分類(lèi)學(xué)研究
　　 通過(guò)對(duì)野外采集的20個(gè)蟲(chóng)草樣本進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)重慶低海拔蟲(chóng)草為一新種，命名為重慶蟲(chóng)草(Cordyceps chongqingensis sp.nov.)。該蟲(chóng)草寄主是一種鱗翅

3、目夜蛾科的幼蟲(chóng)。蟲(chóng)體大小一般為40-50×5 mm。寄主體表被黃色菌絲層。子座1-3個(gè)，生于寄主頭部，柄彎曲，25-35×2.5-4 mm；可孕部柱狀，與柄有明顯界限，黃綠色，25-35×5-7 mm。子囊殼安瓿形，部分埋生，811-1210(-1524)×1127-1343μm。子囊柱狀，5-7.5×170-200μm，子囊帽寬度略小于子囊，子囊孢子4個(gè)，呈線形，2-3×30-45μm。
　　 采用隨機(jī)取樣，對(duì)蟲(chóng)草菌進(jìn)行多途徑

4、分離純化，獲一菌株CQM1T，經(jīng)接種至加富米飯培養(yǎng)基上培養(yǎng)1.5個(gè)月，長(zhǎng)出與野生蟲(chóng)草完全相同的子座，從而確證CQM1T為重慶低海拔蟲(chóng)草的無(wú)性型菌株。
　　 采用形態(tài)特征鑒定和分子特征鑒定相結(jié)合，鑒定重慶低海拔蟲(chóng)草的無(wú)性型菌株CQM1T。通過(guò)觀察CQM1T菌株培養(yǎng)的菌落特征和顯微特征，測(cè)定其核糖體26SrDNA D1/D2區(qū)和ITS區(qū)全序列，確定重慶低海拔蟲(chóng)草的無(wú)性型為戴氏綠僵菌(Metarhizium taii)的一種變種，命名

5、為戴氏綠僵菌重慶變種(Metarhizium taii var.chongqingense nov.)
　　 CQM1T形態(tài)特征鑒定：CQM1T在Sabouraud、PDA和Czapek培養(yǎng)基上，菌落初期白色，茸狀，產(chǎn)孢階段菌落中間呈一叢叢墨綠色的分生孢子堆；常見(jiàn)產(chǎn)孢方式為菌絲側(cè)邊直接產(chǎn)生單個(gè)瓶梗產(chǎn)孢，或菌絲頂端直接形成長(zhǎng)柱形瓶梗產(chǎn)孢，或在一級(jí)分生孢子梗上產(chǎn)生兩個(gè)瓶梗產(chǎn)孢，孢子鏈狀排列；分生孢子有的長(zhǎng)橢圓形，中部稍縊縮，兩端對(duì)稱

6、或者一端變細(xì)尖，有的呈梭形，兩端變尖。
　　 將該菌的產(chǎn)孢方式、孢子大小以及菌落形態(tài)等與綠僵菌屬已知種檢索表相比較，有如下幾點(diǎn)區(qū)別：①產(chǎn)孢方式有三種，以菌絲側(cè)直接產(chǎn)生單瓶梗產(chǎn)單孢子鏈最常見(jiàn)；②產(chǎn)生的孢子形狀不一，同一孢子鏈存在長(zhǎng)橢圓形和梭形兩種形狀；③分生孢子變幅大，一般和金龜子綠僵菌大孢變種粗細(xì)差不多，但長(zhǎng)度稍短，同時(shí)又比其它綠僵菌長(zhǎng)些。因此，此綠僵菌系一新種。
　　 CQM1T分子特征鑒定：對(duì)CQM1T的核糖體26S

7、 rDNA D1/D2區(qū)和ITS區(qū)全序列進(jìn)行測(cè)序，得到26S rDNA D1/D2的序列長(zhǎng)度為601 bp，ITS區(qū)為553 bp。用鄰接法構(gòu)建了蟲(chóng)草無(wú)性型菌株的26S rDNA D1/D2和ITS區(qū)兩個(gè)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。在26SrDNAD1/D2區(qū)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上，可以看出與Metarhizium chongqingensis CQM1T的親緣關(guān)系最近的是Cordyceps taiiT，并且，兩者在此區(qū)域有563bp完全相同。在ITS區(qū)系統(tǒng)發(fā)育

8、樹(shù)上，Metarhizium chongqingensis CQM1T的親緣關(guān)系最近的是Metarhizium taii G97017T，并且，兩者在此區(qū)域的535 bp中相似率為98％。文獻(xiàn)報(bào)道Metarhizium taii是Cordyceps taii的無(wú)性型。因此，重慶低海拔蟲(chóng)草Cordycepschongqingensis sp.nov.的無(wú)性型是綠僵菌，并且根據(jù)對(duì)其26SrDNA D1/D2和ITS區(qū)序列的分析，發(fā)現(xiàn)其為戴氏

9、綠僵菌(Metarhizium taii)的一種變種，因此，命名為戴氏綠僵菌重慶變種(Metarhizium taii var.chongqingense nov.)。
　　 2.CQM1T菌絲體培養(yǎng)條件研究
　　 首先是培養(yǎng)基篩選，參考察氏培養(yǎng)基，分別進(jìn)行碳源和氮源篩選。結(jié)果表明，小分子碳源蔗糖和葡萄糖的效果比多糖糊精和玉米淀粉好，并且葡萄糖的效果最好。但為了減少生產(chǎn)成本，選擇最佳碳源為蔗糖，其含量為3％。而有機(jī)氮源中

10、，魚(yú)粉效果培養(yǎng)的菌絲量最多。其次是豆餅粉，考慮到成本問(wèn)題，且0.5％豆餅粉產(chǎn)生的菌絲量與魚(yú)粉相差不大，選用0.5％的豆餅粉。綜合碳源和氮源的篩選結(jié)果，蟲(chóng)草菌絲體的生長(zhǎng)培養(yǎng)基為：NaNO30.2％，K2HPO40.1％，KCl0.05％，MgSO4·7H2O0.05％，F(xiàn)eSO40.001％，蔗糖3.0％，蠶蛹粉0.5％，豆餅粉0.5％。其次采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)相結(jié)合，對(duì)生長(zhǎng)溫度、pH和搖床轉(zhuǎn)速進(jìn)行篩選。結(jié)果CQM1T菌絲體培養(yǎng)的最佳

11、條件為：溫度28℃，pH5.0，轉(zhuǎn)速180 r/min。最優(yōu)條件下培養(yǎng)，CQM1T在第7d菌絲量達(dá)最大，菌絲得率為：35.6 g/L。
　　 3.CQM1T抗菌活性物質(zhì)的發(fā)酵條件篩選
　　 首先，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選，在已確定的生長(zhǎng)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別缺失NaNO3，K2HPO4，KCl，MgSO4·7H2O，F(xiàn)eSO4進(jìn)行無(wú)機(jī)鹽篩選，結(jié)果表明：因子NaNO3和KCl缺失，其最高活性降低；而FeSO4和MgSO4·7H2

12、O缺失對(duì)活性影響較??；缺少K2HPO4時(shí)，最高活性卻有所升高，所以發(fā)酵培養(yǎng)基成分去掉K2HPO4，保留KCl和NaNO3。然后，進(jìn)行碳氮比的篩選，結(jié)果，最佳的碳氮比為30：1，并且有機(jī)氮源采用蠶蛹粉的所有組的發(fā)酵液活性都比豆餅粉高。因此，選用發(fā)酵培養(yǎng)基為：NaNO30.05％，KCl0.05％，蔗糖3.0％，蠶蛹粉0.05％。最后，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)相結(jié)合，選用溫度、pH和搖床轉(zhuǎn)速為篩選因素進(jìn)行篩選。結(jié)果，搖瓶最佳發(fā)酵條件為：溫度

13、25℃，pH6.5，轉(zhuǎn)速200 r/min。在最佳發(fā)酵條件下，發(fā)酵活性在第6 d達(dá)最大，其對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌圈為：30.4 mm。
　　 4.抗菌活性化合物分離純化及其結(jié)構(gòu)確證
　　 經(jīng)過(guò)反復(fù)研究，篩選出了抗菌活性化合物A、B的分離純化方法即發(fā)酵液經(jīng)過(guò)大孔樹(shù)脂脫色、丙酮沉淀、柱層析、正丁醇萃取和HPLC制備獲得白色化合物A和B。經(jīng)理化性質(zhì)分析和波譜(UV、IR、EI-MS、1H-NMR、13C-NMR)初步解析，化合物

14、A、B均為寡糖類(lèi)化合物，其結(jié)構(gòu)有待進(jìn)一步確證。
　　 5.CQM1T培養(yǎng)物的其它有效成分分析
　　 對(duì)重慶低海拔蟲(chóng)草無(wú)性型菌株CQM1T菌絲體及培養(yǎng)液中的五種主要有效成分進(jìn)行了測(cè)定，并與其它蟲(chóng)草菌絲體進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，CQM1T菌絲體中的蟲(chóng)草酸(甘露醇)、蟲(chóng)草多糖、蛋白質(zhì)含量及氨基酸總量都高于其它蟲(chóng)草(只北冬蟲(chóng)夏草粗蛋白含量略高于CQM1T)，尤其是蟲(chóng)草酸和蟲(chóng)草多糖的含量要明顯高于其它蟲(chóng)草。氨基酸總量基本接近，含有十

15、七種氨基酸，其中谷氨酸含量最高，必需氨基酸含量較豐富，占氨基酸總量的36.45％。因此，單從有效成分組成來(lái)看，重慶低海拔蟲(chóng)草完全可以替代日益匱乏的冬蟲(chóng)夏草等，進(jìn)行菌絲體大規(guī)模培養(yǎng)。
　　 基于上述，本文對(duì)重慶低海拔蟲(chóng)草進(jìn)行鑒定，是一新種，命名重慶蟲(chóng)草(Cordyceps chongqingensis sp.nov.)。重慶低海拔蟲(chóng)草的無(wú)性型進(jìn)行分離鑒定，確定為戴氏綠僵菌變種，命名為戴氏綠僵菌重慶變種(Metarhizium ta

16、ii var.chongqingense nov.)。研究表明，該蟲(chóng)草與目前我國(guó)研究最多的冬蟲(chóng)夏草相比：①生長(zhǎng)條件溫和(最適生長(zhǎng)溫度28℃，冬蟲(chóng)夏草最適生長(zhǎng)溫度18-20℃)，生長(zhǎng)速度快(周期7 d，冬蟲(chóng)夏草為1個(gè)月)。②不僅其有效成分(氨基酸、多糖、蟲(chóng)草酸、蛋白質(zhì)等)含量同冬蟲(chóng)夏草等相似甚至優(yōu)于其它蟲(chóng)草，更重要的是能產(chǎn)生較強(qiáng)活性的廣譜抗菌化合物。本文通過(guò)分離、純化、制備了抗菌化合物A和B，并通過(guò)結(jié)構(gòu)初步分析，推測(cè)為寡糖結(jié)構(gòu)，為進(jìn)一步開(kāi)