短尾蝮蛇毒解離素體外抗JEG-3細胞轉(zhuǎn)移和侵襲及相關(guān)信號通路的研究.pdf

1、解離素是主要存在于蝮科蛇毒中的能夠阻斷整合素與其配體結(jié)合的一類富含半胱氨酸的小分子多肽，含有精-甘-天冬氨(Arg-Gluy—Asp，RGD)、或賴-甘-天冬氨酸(Lys-Gluy-Asp，KGD)等特殊序列。這些序列是解離素或整合素配體與整合素結(jié)合的識別與結(jié)合位點，含有RGD或KGD序列的解離素可以與整合素配體如細胞外基質(zhì)(extracellular matrixc,ECM)、纖維蛋白原（fibrinogen，F(xiàn)g），層粘連蛋白（fi

2、bronectin，F(xiàn)N）等競爭性地與整合素結(jié)合，干擾腫瘤細胞與ECM或與其他細胞間的相互作用，抑制血小板聚集形成瘤栓、腫瘤血管新生，降低腫瘤細胞侵潤、轉(zhuǎn)移的能力。
　　本課題從短尾蝮蛇毒(Gloydius brevicaudusvenom，GBV)分離純化獲得解離素（disintegrin，GBV-DI），觀察其對人絨毛膜癌細胞株JEG-3增殖，粘附，遷移和侵襲等能力的影響，并初步觀察其對與細胞增殖、分化和遷移有密切關(guān)系的信號通

3、路如Id1、MMP9和CD73等RNA表達的影響，為進一步的研發(fā)提供實驗依據(jù)。
　　1.解離素對JEG-3細胞體外增殖的影響
　　以體外培養(yǎng)的JEG-3細胞為研究對象，解離素0、5、10、15、20和25μg/ml處理24h。倒置顯微鏡下觀察對照組和給藥各組細胞形態(tài)變化和生長情況：4h后對照組細胞基本貼壁，地毯式鋪開生長，而給藥各組細胞形態(tài)呈圓形，微貼壁，濃度越高組細胞形態(tài)越圓（如剛接種入板時的細胞狀態(tài)）；12h后對照組細胞

4、向外“潮水般”鋪開生長，而給藥各組細胞生長范圍受限，呈“內(nèi)凹”生長，劑量越高生長面積越受限，“內(nèi)凹”越明顯；24h后，對照組細胞基本鋪滿整個板底，給藥組5，10，15μg/ml細胞逐漸鋪開，但細胞和細胞之間布滿“類弧形空白地帶”，而20和25μg/m l給藥組細胞向周邊鋪開生長幾乎停滯，細胞呈類“工”字形成團生長，細胞發(fā)黑，堆疊。MTT法檢測490nm處各組吸光度值（A490），解離素各組在體外對JEG-3細胞增殖具有顯著的抑制作用（P

5、<0.01），且其作用呈現(xiàn)劑量依賴性。半數(shù)抑制率（IC50）為18.60μg/ml,當終濃度為25μg/ml時，其抑制率可達到69.47％。
　　2.解離素對JEG-3細胞體外粘附的影響
　　細胞-基質(zhì)粘附實驗觀察解離素對JEG-3細胞粘附能力的影響。JEG-3細胞和解離素0、5、10、20、35、40μg/ml作用2h后，接種入鋪有Fn的96孔板再孵育7h，倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀況，對照組細胞數(shù)目較多，形態(tài)較扁平，生長

6、良好，規(guī)則呈“多邊形”排列；解離素組粘附細胞數(shù)目較少（40μg/ml組最少），形態(tài)較圓，生長不規(guī)則，皺縮成團（40μg/ml組最明顯）。MTT法檢測490 nm處各組吸光度值（A490），結(jié)果顯示解離素0、5、10、20、35、40μg/ml對應(yīng)的抑制率分別為20.26、29.31、40.41、49.63和52.62%，結(jié)果有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義。
　　3.解離素對JEG-3細胞體外遷移的影響
　　劃痕實驗檢測解離素對JEG-3

7、細胞體外遷移的影響。在JEG-3細胞上劃痕后，用解離素（0,18μg/ml）處理，倒置顯微光鏡下觀察并記錄0、24和48h時的細胞狀態(tài)。24h后可見對照組細胞逐漸向劃痕區(qū)域運動，而18μg/ml組細胞無遷移反而出現(xiàn)弧形皺縮，劃痕區(qū)范圍明顯變大，48h后對照組細胞長勢更密集了些，而18μg/ml組出現(xiàn)大范圍類“圓形”皺縮，生長狀態(tài)更差了。顯示解離素能夠顯著降低JEG-3細胞運動遷移能力。
　　4.解離素對JEG-3細胞體外侵襲的影響

8、
　　應(yīng)用 Transwell小室重建基底膜侵襲實驗分析解離素對 JEG-3細胞侵襲能力的影響。解離素0、18μg/ml作用JEG-3細胞24h后，倒置顯微鏡下觀察，對照組細胞穿透微孔膜到下室，侵襲Matrigel膠的細胞數(shù)目較多，生長狀態(tài)良好，細胞形態(tài)較規(guī)則，而經(jīng)解離素18μg／m1處理的細胞穿膜數(shù)量顯著減少，細胞生長狀態(tài)較差，細胞分散，形態(tài)較不規(guī)則。按 IR（%）=（1-實驗對照組侵襲平均細胞數(shù)/對照組平均侵襲細胞數(shù)）×100

9、%，計算侵襲抑制率，得出抑制率為50.9%。顯示解離素能顯著降低JEG-3細胞侵襲基底膜的能力。
　　5.解離素對JEG-3細胞凋亡的影響
　　采用Annexin V FITC/PI雙染流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率。解離素作用于JEG-3細胞24h后，Annexin V FITC/PI流式細胞儀可將實驗樣本中的正常、壞死、晚期凋亡和早期凋亡的細胞區(qū)分開來。分別計數(shù)各組四個象限細胞比例，分析發(fā)現(xiàn)，解離素18μg/m l濃度組的早期

10、凋亡率，存活率，晚期凋亡率分別為17.3%±2.24%，67.3%±6.63%，14.7%±3.54%，和對照組的6.0%±5.89%，85.4%±8.78%，7.8%±4.31%相比，實驗組早期凋亡率和晚期凋亡率均增高了，差異具有顯著性（P<0.05）。
　　6.解離素對JE G-3細胞中Id1，MMP9, CD73mRNA表達的影響
　　采用 RT-PCR法檢測解離素處理 JEG-3細胞后，細胞中細胞分化抑制因子1(in

11、hibitor ofdifferentiation or inhibitor of DNA binding1,Id1)，反應(yīng)腫瘤侵襲力的金屬基質(zhì)蛋白酶-9(MMP9)和與腫瘤細胞黏附、遷移和侵襲有關(guān)的胞外-5’-核苷酸酶(Ecto-5’-Nucleotidase，EC3．1．3．5，ecto．5’-NT)（又稱CD73）的mRNA表達表達情況。分別以0μg/ml和4μg/ml作用于JEG-3細胞24h后，提取總RNA進行RT-PCR，檢