喹諾里西啶類生物堿對白血病細(xì)胞的聯(lián)合作用效應(yīng).pdf

1、研究背景：
　　中藥主要來自草本植物，在我國有數(shù)千年臨床應(yīng)用史，中藥組方被廣泛用于各種疾病的治療。通過幾種藥物的配合使用，能有效增強(qiáng)藥效，或降低用藥劑量。隨著科學(xué)的進(jìn)步，現(xiàn)代生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究顯示，中藥的藥用成分有生物堿、有機(jī)酸、黃酮、皂苷、多糖、維生素、礦物質(zhì)和各種微量元素?；睂僦参锸且环N傳統(tǒng)中藥，屬于豆科蝶形花亞科，主要分布于溫帶和亞熱帶地區(qū)，約80余種，我國約有20余種?；睂僦参镏兴幹械目鄥⒑蜕蕉垢侵嗅t(yī)臨床清熱解毒方治療腫瘤

2、的常用藥物[1-5]。生物學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)合化學(xué)分析顯示槐屬植物中藥主要活性成分為生物堿，高效液相分析發(fā)現(xiàn)生物堿主要為喹諾里西啶類生物堿。近年研究顯示，槐屬植物中藥的喹諾里西啶類生物堿具有抗腫瘤作用[6]。
　　根據(jù)喹諾里西啶類生物堿分子的母核結(jié)構(gòu)不同可分為6類：苦參堿型、苦豆堿型、金雀花堿型、鷹爪豆堿型和羽扇豆堿型、蘇苦西堿型。目前市售的主要有苦參堿型生物堿，如苦參堿、槐定堿、槐果堿和氧化苦參堿，以及分別屬于苦豆堿型、金雀花堿型、鷹爪豆

3、堿型的代表性化合物苦豆堿、金雀花堿和鷹爪豆堿，它們在槐屬植物中藥含量較高，便于分離純化，多有市售，其中苦參注射液已被臨床納入抗腫瘤治療藥物[6,7]。由于苦參注射液是一個復(fù)合制劑，所含成分復(fù)雜，目前尚無研究資料顯示不同生物堿聯(lián)合應(yīng)用是否有利于疾病的治療。因此，研究上述生物堿的聯(lián)合應(yīng)用可了解喹諾里西啶類生物堿是否有聯(lián)合應(yīng)用的價值。
　　近年來的研究顯示，喹諾里西啶類生物堿在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的同時誘發(fā)其自噬，其機(jī)制可能與mTOR、Be

4、clin1等自噬相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)節(jié)有關(guān)。本課題組曾報道過苦豆堿誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡時引發(fā)其自噬，然對其機(jī)制未作深入探究[10]。鑒于自噬在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的重要作用，探究喹諾里西啶類生物堿的自噬激活機(jī)制對提高其抗腫瘤效應(yīng)具有重要意義。
　　研究目的：
　　通過分析六種喹諾里西啶類生物堿不同型之間倆倆聯(lián)合以及苦參堿型三種亞型的倆倆聯(lián)合抗白血病效應(yīng)，探討槐屬植物中藥中多樣的生物堿化學(xué)成分是否存在相互作用，促進(jìn)或影響腫瘤治療的效果

5、，為臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。在當(dāng)前喹諾里西啶類生物堿抗腫瘤作用機(jī)制研究的基礎(chǔ)上，探究自噬在其抗腫瘤過程中的影響機(jī)制，為今后靶向自噬以提高喹諾里西啶類生物堿抗腫瘤效應(yīng)提供理論依據(jù)。
　　研究方法：
　　1.首先選用MTT比色法觀察藥物對白血病細(xì)胞增殖抑制作用，以及劑量依賴程度，計算各自的IC50；
　　2.運(yùn)用 MTT比色法觀察了六種喹諾里西啶類生物堿倆倆聯(lián)合對倆種白血病細(xì)胞聯(lián)合作用效應(yīng)，得出上述藥物單獨(dú)及聯(lián)合處理時抑制率

6、，用 SPSS17.0計算其倆倆聯(lián)合的聯(lián)合指數(shù)CI（Combination Index）值；
　　3.利用吖啶橙染色觀察了藥物誘導(dǎo)白血病細(xì)胞自噬現(xiàn)象；
　　4.蛋白免疫印跡（Western blotting）和RT-PCR等方法觀察了藥物誘導(dǎo)白血病細(xì)胞自噬或凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)或剪切情況。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1.在適當(dāng)?shù)乃幬飫┝孔饔孟?，六種喹諾里西啶類生物堿對K562和HL-60白血病細(xì)胞呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，苦豆堿

7、的體外抗腫瘤作用最明顯，其次是鷹爪豆堿；苦參堿型生物堿體外抗腫瘤作用效果相近。
　　2.喹諾里西啶類生物堿不同型之間倆倆聯(lián)合時，苦參堿與苦豆堿、苦豆堿與鷹爪豆堿倆倆聯(lián)合時在K562細(xì)胞中顯現(xiàn)聯(lián)合效應(yīng)，在HL-60細(xì)胞中無聯(lián)合效應(yīng)，其他的聯(lián)合組在倆個細(xì)胞中均無聯(lián)合效應(yīng)。
　　3.喹諾里西啶類生物堿處理K562和HL-60細(xì)胞48小時后，生物堿單藥或聯(lián)合用藥組在二株細(xì)胞中均發(fā)生了自噬現(xiàn)象。Western blotting以及RT

8、-PCR結(jié)果顯示上述藥物在K562細(xì)胞自噬活性的改變與自噬相關(guān)基因mTOR表達(dá)被抑制有關(guān)，而HL-60細(xì)胞中的自噬活性改變與自噬相關(guān)基因Beclin1表達(dá)上調(diào)有關(guān)。
　　4.苦參堿與苦豆堿、苦豆堿與鷹爪豆堿二組實(shí)驗(yàn)組對K562細(xì)胞系的誘導(dǎo)凋亡檢測實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)有聯(lián)合效應(yīng)，凋亡蛋白PARP在聯(lián)合組發(fā)生剪切，表明上述藥物的聯(lián)合機(jī)制與誘導(dǎo)凋亡發(fā)生機(jī)制有關(guān)。
　　結(jié)論：
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示槐屬植物中藥苦參或山豆根等單味中藥所含的喹諾