神經(jīng)節(jié)苷脂GD2在大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離和鑒定研究中的應(yīng)用.pdf

1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSCs)，也稱(chēng)為骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，是骨髓中的一種成體干細(xì)胞，占骨髓來(lái)源單核細(xì)胞群的比例不到0.01％。一直以來(lái)由于沒(méi)有找到理想的用于鑒定BM-MSCs的特異性標(biāo)志，通常采用多種表面分子聯(lián)合鑒定體外培養(yǎng)的BM-MSCs。最近一種新發(fā)現(xiàn)的表面分子神經(jīng)節(jié)苷脂GD2，被用來(lái)鑒定人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSCs)和臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(UC-MSCs)等間充質(zhì)干細(xì)胞。但大鼠BM-MSCs是否表達(dá)GD2還未見(jiàn)報(bào)道，本試驗(yàn)研究了

2、大鼠BM-MSCs的GD2表達(dá)情況，為探索特異性分離、準(zhǔn)確鑒定大鼠BM-MSCs提供新的技術(shù)途徑;實(shí)驗(yàn)還應(yīng)用percoll密度梯度離心法對(duì)大鼠BM-MSCs的分離方法進(jìn)行了優(yōu)化，都為獲得可用于移植的高純度BM-MSCs建立了技術(shù)平臺(tái)。
　　實(shí)驗(yàn)一、大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)節(jié)苷脂GD2的實(shí)驗(yàn)研究
　　方法:
　　(1) BM-MSCs的分離和體外純化培養(yǎng):運(yùn)用全骨髓貼壁法分離8-10周齡SD大鼠BM-MSCs，以1×

3、109個(gè)/ml接種于含15％胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基，37℃、5％CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　(2) GD2合成酶mRNA表達(dá)的檢測(cè):以大鼠胚胎成纖維細(xì)胞（REFs）和小鼠黑色素瘤細(xì)胞(B16F10)分別作為陰性和陽(yáng)性對(duì)照，應(yīng)用RT-PCR法檢測(cè)第一代、第三代和第五代BM-MSCs的GD2合成酶mRNA表達(dá)情況。
　　(3) BM-MSCs膜表面GD2的檢測(cè):應(yīng)用細(xì)胞免疫組化法，檢測(cè)第一代、第三代和第五代BM-MS

4、Cs表面GD2的表達(dá)。
　　(4) BM-MSCs表面分子CD3、CD29、CD45、CD90表達(dá)的檢測(cè):應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)第一代、第三代和第五代BM-MSCs表面分子群(CD3、CD29、CD45、CD90)的表達(dá)，對(duì)BM-MSCs表面分子群的表達(dá)結(jié)果與表面分子GD2流式檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較分析。
　　結(jié)果:
　　(1) BM-MSCs的培養(yǎng)與傳代:全骨髓貼壁法培養(yǎng)BM-MSCs從原代培養(yǎng)到傳代培養(yǎng)周期很長(zhǎng)，需8-10d

5、方可傳代，以后傳代培養(yǎng)周期縮短，每三天即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
　　(2) BM-MSCs GD2合成酶mRNA的表達(dá):原代細(xì)胞中GD2合成酶mRNA表達(dá)較低，隨著傳一、二、三代，細(xì)胞內(nèi)GD2合成酶mRNA表達(dá)量隨之增加，之后再進(jìn)行傳代培養(yǎng)顯示GD2合成酶mRNA表達(dá)處在一個(gè)穩(wěn)定水平。REFs陰性表達(dá)GD2合成酶mRNA，B16F10陽(yáng)性表達(dá)GD2合成酶mRNA。
　　(3) BM-MSCs膜表面GD2分子表達(dá):細(xì)胞免疫化學(xué)結(jié)果顯

6、示在第一代、第三代和第五代BM-MSCs的膜表面均表達(dá)GD2。
　　(4) BM-MSCs表面分子群的表達(dá):以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BM-MSCs的表面分子群，CD90陽(yáng)性細(xì)胞比率，第一、三、五代分別為59.2％、87.1％、98.2％; CD29陽(yáng)性細(xì)胞比率，第一、三、五代分別為69％、80.9％、99.9％; CD45陽(yáng)性細(xì)胞比率，第一、三、五代分別為13.8％、5.1％、1.1％; CD3陽(yáng)性細(xì)胞比率，第一、三代分別為4.4％、0.

7、8％;GD2陽(yáng)性細(xì)胞比率，第一、三、五、七代分別為87.3％、48.2％、36.2％、18.9％。
　　結(jié)論:
　　(1)全骨髓貼壁法能成功分離培養(yǎng)大鼠BM-MSCs，體外培養(yǎng)的原代BM-MSCs和傳一代、三代、五代的細(xì)胞內(nèi)均表達(dá)GD2合成酶mRNA和膜表面GD2，與人和小鼠的研究結(jié)果一致，提示GD2種屬間的保守性很高。
　　(2)隨著體外傳代培養(yǎng)，細(xì)胞內(nèi)GD2合成酶mRNA表達(dá)量呈遞增變化而流式檢測(cè)細(xì)胞表面分子GD2

8、陽(yáng)性細(xì)胞比率呈遞減變化，GD2合成酶是GD2生物合成過(guò)程中的一種限速酶，由于BM-MSCs從體內(nèi)到體外環(huán)境的改變，GD2合成酶在mRNA水平表達(dá)量增高并沒(méi)有提高膜表面GD2分子陽(yáng)性細(xì)胞比率。其具體調(diào)節(jié)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
　　(3)體外傳代培養(yǎng)大鼠BM-MSCs過(guò)程中，膜表面分子GD2陽(yáng)性細(xì)胞比率呈遞減變化，說(shuō)明體外培養(yǎng)的BM-MSCs表面分子GD2的表達(dá)逐漸減少，與文獻(xiàn)報(bào)道的GD2可以作為鑒定人和小鼠早期MSCs的特異性標(biāo)志一致

9、。
　　(4)隨著傳代純化培養(yǎng)的進(jìn)行，通常用于聯(lián)合鑒定的表面分子CD90、CD45陽(yáng)性細(xì)胞比率呈遞增變化，到第五代時(shí)CD90、CD45雙陽(yáng)性細(xì)胞比率達(dá)98％，細(xì)胞純度高，可用于后續(xù)試驗(yàn)研究。
　　實(shí)驗(yàn)二、應(yīng)用神經(jīng)節(jié)苷脂GD2分離和鑒定大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞研究
　　方法:
　　(1)采用Percoll密度梯度離心法分離培養(yǎng)大鼠BM-MSCs，RT-PCR檢測(cè)不同密度梯度層細(xì)胞(1.0448g/ml、1.0578g/

10、ml、1.0708g/ml、1.0838 g/ml、1.0968 g/ml)GD2合成酶mRNA的表達(dá)，確定BM-MSCs所處的密度層，為快速獲得BM-MSCs提供依據(jù)。
　　(2)對(duì)密度梯度離心法分離獲得的BM-MSCs進(jìn)行體外培養(yǎng)，觀(guān)察細(xì)胞的形態(tài)及生長(zhǎng)特性，采用四甲基噻唑藍(lán)(MTT)比色試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力，繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)，并與全骨髓貼壁法培養(yǎng)的細(xì)胞活力進(jìn)行比較。
　　(3)應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)密度梯度離心分離得到的BM-MSC

11、s表面分子群(CD3、CD29、CD45、CD90)的表達(dá)，檢測(cè)其純度。
　　結(jié)果:
　　(1) RT-PCR試驗(yàn)結(jié)果顯示，僅在1.0708 g/ml這一密度層的細(xì)胞有GD2合成酶mRNA的表達(dá)。
　　(2)密度梯度離心得到的細(xì)胞接種后，剛開(kāi)始增殖慢，適應(yīng)一段時(shí)間后，經(jīng)6-7d原代培養(yǎng)后即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)的周期為2-3d，與全骨髓貼壁法傳代培養(yǎng)的周期相近。MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)傳代后的細(xì)胞活力較高，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞在接

12、種后15h左右。
　　(3)密度梯度離心獲得的細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)，流式細(xì)胞檢測(cè)一代細(xì)胞表面分子CD90、CD29、CD45、CD3陽(yáng)性細(xì)胞比率分別為88.5％、99.9％、0.2％、0.1％，其純度高于全骨髓貼壁法獲得的一代細(xì)胞。
　　結(jié)論:Percoll密度梯度離心法能夠快速獲得BM-MSCs，離心過(guò)程中細(xì)胞受到一定損傷，接種培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)貼壁所需的時(shí)間較貼壁分離法長(zhǎng)，一般原代培養(yǎng)6-7d可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代后的細(xì)胞活力增高，增殖

13、快;流式細(xì)胞檢測(cè)密度梯度獲得的傳一代BM-MSCs表面分子群CD3、CD29、CD45、CD90陽(yáng)性細(xì)胞比率比全骨髓貼壁法獲得的一代細(xì)胞的純度高。傳一代后細(xì)胞形態(tài)趨于一致，采用MTT比色檢測(cè)密度梯度離心獲得的一代、二代、三代生長(zhǎng)良好的細(xì)胞活力，繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)，與全骨髓貼壁法培養(yǎng)的一代、二代、三代細(xì)胞進(jìn)行比較。密度梯度離心得到的細(xì)胞活力高于全骨髓貼壁法，且密度梯度離心培養(yǎng)的細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期在接種后的15h左右，相比貼壁細(xì)胞的24h，其增殖周期