TRPC1對豐富環(huán)境誘導(dǎo)的成年海馬神經(jīng)發(fā)生及認(rèn)知功能增強(qiáng)的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、背景:豐富環(huán)境（environmental enrichment，EE）與海馬可塑性有關(guān)，其中包括增加神經(jīng)發(fā)生和改善認(rèn)知能力等。而且，豐富環(huán)境還可以改善壓力、老化以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病等引起的腦功能損傷。豐富環(huán)境調(diào)節(jié)海馬可塑性和改善腦功能的機(jī)制非常復(fù)雜，至今仍不十分清楚。經(jīng)典瞬時受體電位1(transient receptor potential1-canonical，TRPC1)通道是Ca2+通透的、非選擇性的陽離子膜通道，在大腦中選擇性的

2、表達(dá)在神經(jīng)元中，并且主要是表達(dá)在神經(jīng)元的胞體和樹突。研究表明TRPC1通道參與調(diào)節(jié)胚胎神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)的自我更新、神經(jīng)突延伸生長以及促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞增殖等。此外，近期研究發(fā)現(xiàn)TRPC1介導(dǎo)的鈣庫操縱性鈣內(nèi)流(store-operated Ca2+entry，SOCE)增加對于體外培養(yǎng)的成年海馬神經(jīng)組細(xì)胞的增殖是必需的。這些研究結(jié)果提示TRPC1可能在神經(jīng)祖細(xì)胞(neural progeni

3、tor cells，NPCs)增殖、海馬可塑性以及學(xué)習(xí)記憶等過程中起著重要作用。但是，豐富環(huán)境誘導(dǎo)的成年神經(jīng)發(fā)生和認(rèn)知功能增強(qiáng)是否由TRPC1及相關(guān)信號通路介導(dǎo)，目前還尚未見報道。
　　目的:1.探討豐富環(huán)境對TRPC1的影響。
　　2.探討TRPC1在豐富環(huán)境增強(qiáng)成年海馬神經(jīng)發(fā)生和認(rèn)知功能中的作用。
　　3.探討TRPC1參與調(diào)節(jié)豐富環(huán)境增強(qiáng)成年海馬神經(jīng)發(fā)生和認(rèn)知功能的機(jī)制。
　　方法:將成年（8-10周齡）野

4、生型（wild-type，WT）129/SvEv雄性小鼠和此基因背景下的TRPC1-/-雄性小鼠分別隨機(jī)分配到標(biāo)準(zhǔn)籠（standard cage，SC；每籠4只）和豐富環(huán)境（environmental enrichment，EE；每籠12只）籠中，每籠中兩種小鼠參半。采用實時定量PCR（Real Time PCR）與蛋白免疫印跡（Western blot）等實驗技術(shù)檢測豐富環(huán)境對TRPC1 mRNA與蛋白表達(dá)水平的影響。腹腔注射5-溴脫

5、氧尿嘧啶核苷（5-Bromo-2-deoxyuridine，BrdU）來標(biāo)記新生神經(jīng)組細(xì)胞，用免疫熒光技術(shù)來研究WT與TRPC1-/-小鼠海馬新生神經(jīng)組細(xì)胞的增殖、分化和存活情況。通過行為學(xué)測試及記錄海馬腦片苔狀纖維(mossy fiber，MF)--海馬CA3（即MF-CA3）通路長時程增強(qiáng)(long-term potentiation，LTP)來檢測各組小鼠學(xué)習(xí)記憶及突觸可塑性的變化情況。而且，為了進(jìn)一步證實TRPC1的作用，通過腦

6、立體定位技術(shù)注射重組腺相關(guān)病毒rAAV2-TRPC1或rAAV2-GFP（作為對照）到各組小鼠海馬齒狀回(dentate gyrus，DG)，并評估這些小鼠在豐富環(huán)境后神經(jīng)發(fā)生及認(rèn)知記憶水平。此外，應(yīng)用Western blot檢測MAPK家族成員及CREB蛋白等表達(dá)水平變化來探討其內(nèi)在機(jī)制。
　　結(jié)果:1.豐富環(huán)境顯著增加成年小鼠海馬TRPC1表達(dá)水平。
　　成年（8-10周齡）WT小鼠隨機(jī)分別飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)籠(standard

7、 cage，SC)與豐富環(huán)境(environmental enrichment，EE)中。四周后，用實時定量PCR和蛋白免疫印跡等實驗技術(shù)檢測到EE組小鼠TRPC1 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著高于SC組小鼠。
　　2．成年TRPC1-/-小鼠表現(xiàn)出豐富環(huán)境誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)發(fā)生及認(rèn)知功能增強(qiáng)障礙。（1）免疫熒光結(jié)果顯示：豐富環(huán)境使WT小鼠神經(jīng)祖細(xì)胞增值及新生神經(jīng)元存活率顯著增加了，而TRPC1-/-小鼠在豐富環(huán)境后神經(jīng)祖細(xì)胞增值及新生

8、神經(jīng)元存活率并沒有明顯的變化。
　　（2）行為學(xué)檢測結(jié)果顯示：豐富環(huán)境使WT小鼠在Morris水迷宮中逃避潛伏期顯著降低和在目標(biāo)象限花更長的時間搜索平臺，在關(guān)聯(lián)條件恐懼中凝滯反應(yīng)時間顯著增加，在新物體識別實驗中明顯更加傾向于對新物體進(jìn)行探索，而TRPC1-/-小鼠豐富環(huán)境后在上述行為學(xué)測試中的表現(xiàn)并沒有明顯的改變。
　?。?）腦片LTP記錄結(jié)果顯示：豐富環(huán)境顯著性地增加了WT組小鼠海馬腦片MF-CA3通路興奮性突觸后場電位(

9、field excitatory postsynaptic potentials，fEPSP)的斜率，而豐富環(huán)境后在TRPC1-/-組小鼠的海馬腦片中并沒有檢測到fEPSP斜率有明顯變化。
　　3.在成年TRPC1-/-小鼠海馬DG區(qū)過表達(dá)TRPC1逆轉(zhuǎn)了豐富環(huán)境誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)發(fā)生以及認(rèn)知功能增強(qiáng)障礙。
　　（1）免疫熒光結(jié)果顯示：豐富環(huán)境后，TRPC1-/-組小鼠神經(jīng)祖細(xì)胞增值及新生神經(jīng)元存活率顯著低于WT組小鼠，而在TR

10、PC1-/-小鼠海馬DG區(qū)過表達(dá)TRPC1后其神經(jīng)祖細(xì)胞增值及新生神經(jīng)元存活率幾乎恢復(fù)到WT小鼠水平。
　　（2）行為學(xué)檢測結(jié)果顯示：豐富環(huán)境后，TRPC1-/-組小鼠在Morris水迷宮中逃避潛伏期顯著高于WT組小鼠及在目標(biāo)象限花的時間顯著低于WT組小鼠，在關(guān)聯(lián)條件恐懼中凝滯反應(yīng)時間顯著低于WT組小鼠，在新物體識別實驗中識別指數(shù)顯著低于WT組小鼠，而在TRPC1-/-小鼠海馬DG區(qū)過表達(dá)TRPC1后其上述各行為學(xué)測試指標(biāo)幾乎恢復(fù)

11、到了WT小鼠水平。
　?。?）腦片LTP記錄結(jié)果顯示：豐富環(huán)境后，TRPC1-/-組小鼠海馬腦片MF-CA3通路fEPSP的斜率顯著低于WT組小鼠，而在TRPC1-/-小鼠海馬DG區(qū)過表達(dá)TRPC1后fEPSP的斜率幾乎恢復(fù)到了WT小鼠水平。
　　4. TRPC1可能是通過ERK1/2-CREB通路來調(diào)節(jié)豐富環(huán)境誘導(dǎo)的成年海馬神經(jīng)發(fā)生以及認(rèn)知功能增強(qiáng)的。
　　為了探討潛在機(jī)制,用蛋白免疫印跡技術(shù)檢測了與豐富環(huán)境、成年海

12、馬神經(jīng)發(fā)生、突觸可塑性及學(xué)習(xí)記憶等有關(guān)的蛋白表達(dá)變化情況，如MAPK家族成員（ERK1/2、p38和JNK）及CREB蛋白等。我們發(fā)現(xiàn)：與WT-SC組小鼠相比，WT-EE組小鼠ERK1/2、p38和CREB（而不是JNK）蛋白磷酸化水平顯著性地增加了；而且TRPC1敲除后顯著性地抑制了豐富環(huán)境誘導(dǎo)的ERK1/2、CREB（而非p38）蛋白磷酸化水平的增加。尤其是，在TRPC1-/-小鼠海馬DG區(qū)過表達(dá)TRPC1能夠使在豐富環(huán)境的情況下被