亞麻木酚素的提取純化與生物活性研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、亞麻籽中含有多種木酚索,其中開環(huán)異落葉松樹脂酚(SECO)的含量最高,SECO以二糖苷開環(huán)異落葉松樹脂酚二葡萄糖苷(SDG)的形式存在于亞麻籽中。研究發(fā)現(xiàn)亞麻木酚素具有多種生物活性,如抗癌、防治心血管疾病、減緩更年期癥狀、預防骨質(zhì)疏松等。開發(fā)利用亞麻木酚素對預防這些膳食模式依賴性的疾病和提高人民身體素質(zhì)具有重要意義。亞麻小酚素的開發(fā)利用還可以大大提高亞麻籽的附加值,產(chǎn)生顯著的經(jīng)濟效益,促進國內(nèi)亞麻資源深加工與利用。 本文通過對亞

2、麻木酚素的測定、提取、純化及亞麻籽綜合利用方法的系統(tǒng)研究,建立了一條SDG提取和純化的工藝路線,具有安全、經(jīng)濟、易于工業(yè)化的優(yōu)點,得劍了高純度(95%以上)的木酚素產(chǎn)品。本文從體外細胞培養(yǎng)和化學計算相結(jié)合的角度出發(fā),研究了亞麻木酚素的抗乳腺癌功效及其作用機理。通過生物活性實驗與理論計算交互驗證的方法解釋了其量效、構(gòu)效關系。 研究發(fā)現(xiàn),在SDG的測定過程中,將堿水解與有機溶劑提取合并可以更充分地從脫脂亞麻籽殼中提取SDG。研究了木

3、酚素測定中普遍采用的酸水解方法對SDG的影響,純化的SDG樣品經(jīng)過酸水解主要生成3種產(chǎn)物,低鹽酸濃度下產(chǎn)物以SECO及開環(huán)異落葉松樹脂酚葡糖苷(SG)為主,提高鹽酸濃度和作用時間,產(chǎn)物以脫水開環(huán)異落葉松樹脂酚(ANHSEC)為主,但木酚素總量降低。采用HPLC-PAD-MS可準確測定SDG、SG、SECO與ANHSEC,采用NMR驗證了HPLC-PAD-MS的測定結(jié)果并鑒別了SDG的構(gòu)型。以SDG為對照,建立了HPLC定最方法,避免了酸

4、水解導致的損失,路線簡便,方法可靠,靈敏度令人滿意。本文還采用比色法測定SDG,使其定量更為方便快捷。 為富集SDG和綜合利用亞麻籽中功能性成分,本文采用濕法脫粘,以粘性脫除率(定義為粘質(zhì)物脫除率與0.1%粘質(zhì)物溶液粘度的乘積)為指標,確定了最適脫粘條件:溫度70℃,水料比7:1,DH 6.0,時間60 min,脫粘4次。分析了所得粗亞麻籽膠的組成,其多糖與蛋白含量分別為65.4%和8.50%(w/w)。其單糖組成(摩爾比例)為

5、鼠李糖:巖藻糖:阿拉伯糖:木糖:葡萄糖:半乳糖=5.10:1.00:4.18:8.98:2.13:2.75,木糖含量最高,表明中性多糖含量較高。采用濕法脫殼,在砂輪間距0.40 mm、砂輪轉(zhuǎn)速2800 rpm、水力分級兩次條件下,富仁、富殼與混合部分的得率分別為52.6%、22.3%和12.7%,總回收率87.7%,仁中含殼率和殼中含仁率分別為20.9%和11.1%,達到較為滿意的程度。分析了亞麻籽脫粘和仁殼分離的影響,發(fā)現(xiàn)部分SDG(

6、9.6%)隨粉碎的殼層流火,SDG主要分布在富殼部分,其次是混合部分,富仁部分含量很少。 采用正交實驗設計的方法優(yōu)化了SDG的攪拌提取條什:提取溶劑為50%乙醇(v/v),溫度60℃,液同比20 mL/g,時間3 h。該條件下SDG的得率達1.80g/100 g脫脂亞麻籽殼粉(DFHF),向提取液中加入0.25 mol/L NaOH時,SDG的得率提高至1.90 g/100 g DFHF。研究了超聲輔助提取對亞麻木酚素得率的影響

7、,發(fā)現(xiàn)超聲功率160 W、時間30 min、溫度40℃的條件下,SDG得率可達到2.01 g/100 g DFHF。采用中心組合設計和響應面分析確定微波輔助提取的工藝條什為:乙醇濃度40.9%(v/v),液固比21.9:1(mL/g),超盧處理5 min進行預浸,在130 w微波功率下輻照90.5 s。該條件下SDG得率為2.19 g/100 g DFHF,高于常規(guī)攪拌提取和超盧輔助提取的得率。圓二色性檢測表明實驗所用微波輻照條件對SD

8、G構(gòu)刑沒有影響。MAE大大縮短了提取時間,顯著提高了SDG的得率,并節(jié)省了能耗。 研究了亞麻水酚素粗提物在止己烷、氯仿、乙酸乙酯和水四種溶劑中的分配特性,發(fā)現(xiàn)SDG極性較大,主要保留在水相中。以洗脫物紫外吸收特征為評判指標,采用硅膠柱層析法二次洗脫分離出SDG產(chǎn)物。HPLC-PAD-MS檢測其純度為91.85%,硅膠柱層析的同收率為92.4%。采用大孔吸附樹脂對SDG粗提物進行了靜態(tài)吸附和解析。篩選出吸附率和解析率分別為86.4

9、%和95.1%的X-5大孔吸附樹脂。采用X-5為分離介質(zhì),研究其動態(tài)吸附特征及合適的洗脫條件,確定采用乙醇溶液進行梯度洗脫分離SDG,在20%乙醇洗脫組分中檢測出SDG,其純度為65.7%,但整個分離過程同收率偏低,為80.8%。采用Sephadex LH-20凝膠柱分離純化SDG,確定水作為洗脫溶劑,二次分離得劍純度96.6%的SDG產(chǎn)物,同收率達到97.2%。 研究了不同濃度SECO及其在人體內(nèi)的代謝產(chǎn)物END與ENL對雌激

10、素剛性乳腺癌細胞MCF-7增殖的抑制作用,并同金雀異黃素(GEN)進行對照,發(fā)現(xiàn)SECO與GEN在較高濃度(分別為100和40 μmol/L)下對MCF-7具有抑制作用,而在低濃度(10~40和10~20μmol/L)下促進MCF-7增殖作用。END和ENL在10~100μmol/L濃度下均表現(xiàn)出對MCF-7增殖的抑制作用。采用流式細胞儀檢測了由100μmol/L 的SECO、40μmol/L的END、ENL與GEN作用斤的MCF-7細

11、胞的周期分布變化,發(fā)現(xiàn)G0/G1期細胞比例增加,S期細胞比例降低,G2/M期細胞比例略有增高,說明SECO、END、ENL與GEN可能是通過影響細胞DNA的增殖來實現(xiàn)對MCF-7的抑制作用的。 采用放射性配基競爭結(jié)合法測定了SECO與α雌激素受體(ER α)的結(jié)合活力,發(fā)現(xiàn)在10μmol/L濃度下SECO不具有與ERα結(jié)合的活力。采用分子對接方法(DOCK)研究了SECO、END、ENL等配基與雌激素受體對接過程中的能量變化(A

12、G),結(jié)果表明△G與配基分子的結(jié)合活力間無明顯的線性相關性,通過對接研究初步確定了ERα與ERβ的配基結(jié)合部位及可能的作用方式。通過比較分子場分析(CoMFA),建立了預測配基分子與ERα、ERβ結(jié)合活力的CoMFA模型,結(jié)果表明氫鍵在模型中起重要作用,模型的預測結(jié)果與實測結(jié)果接近。采用該模型預測了END、ENL及SECO同ERβ與ERα的相對結(jié)合活力,結(jié)果表明ENL的結(jié)合活力遠高于SECO,并且三者與ERβ的結(jié)合活力均高于與ERβ的結(jié)

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