多發(fā)性骨髓瘤14q32染色體易位的分子生物學(xué)研究.pdf

1、多發(fā)性骨髓瘤(multiplemyeloma，MM)是漿細(xì)胞的惡性增殖性疾病，至今仍屬不能治愈的腫瘤。深入研究MM的發(fā)病機(jī)制，尋找致病的關(guān)鍵性分子異常及針對(duì)性治療策略是目前MM研究中的熱點(diǎn)問(wèn)題。免疫球蛋白重鏈基因(ImmunoglobulinHeavyChain，IgH)相關(guān)的染色體易位是MM最常見(jiàn)的染色體結(jié)構(gòu)異常，被認(rèn)為是發(fā)病過(guò)程中早期的、特征性的分子事件，可能在MM發(fā)生發(fā)展中起重要作用。 該研究建立了便捷的IgH基因相關(guān)染色

2、體易位的分子生物學(xué)檢測(cè)方法以應(yīng)用于臨床檢測(cè)，并對(duì)有t(4；14)的骨髓瘤的分子發(fā)病機(jī)制與繼發(fā)的癌基因異常表達(dá)作為治療靶點(diǎn)的意義進(jìn)行了初步的研究。 第一部分 參考國(guó)外專(zhuān)利文獻(xiàn)與研究報(bào)道，自行設(shè)計(jì)并合成了6種分別針對(duì)限制性?xún)?nèi)切酶BamHⅠ，ClaⅠ，EcoRⅠ，HindH，PvuⅡ，Rasl的雙鏈短DNA片段小載體。構(gòu)建了健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞株U266細(xì)胞的小載體文庫(kù)。應(yīng)用LaTaq酶，以通用型小載體

3、引物與S區(qū)的引物行半巢式長(zhǎng)距離PCR擴(kuò)增各小載體文庫(kù)，健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞基因組的PvuⅡ文庫(kù)，以通用小載體引物與巢式引物m1：m2；a1：a2；g1：g2可分別擴(kuò)增出250bp、610bp、750bp的與預(yù)想片段大小一致的片段。對(duì)U266的EcoRⅠ小載體文庫(kù)，以小載體引物和a1：a2可以擴(kuò)增出3.5kb的片段。PCR產(chǎn)物測(cè)序證實(shí)該骨髓瘤細(xì)胞存在t(11;14)。說(shuō)明此方法可以有效的檢測(cè)IgH基因相關(guān)的染色體易位，可大規(guī)模應(yīng)用于臨床

4、檢測(cè)。 第二部分 1、以多種公共軟件對(duì)MMSET進(jìn)行了的生物信息學(xué)分析。 2、設(shè)計(jì)針對(duì)SET結(jié)構(gòu)的引物，以RT-PCR方法從骨髓瘤細(xì)胞株LP1中得到編碼MMSET的SET結(jié)構(gòu)的870bp的cDNA片段。 3、將此片段克隆至pGEX-6p1，成功的構(gòu)建了MMSET的表達(dá)載體，命名為pGEX-6p1-MMSET。并在大腸桿菌中表達(dá)出融合蛋白。 4、將產(chǎn)物與H3-SAM和核心組蛋白共孵育，SD

5、S-PAGE電泳后，行放射自顯影，可以見(jiàn)到在H3和H4組分對(duì)應(yīng)的位置的顯影，說(shuō)明該重組蛋白有上述兩種組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的作用。對(duì)MMSET的該功能的揭示，提示組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的功能的改變，可能通過(guò)影響染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和基因轉(zhuǎn)錄狀態(tài)，活化癌基因或抑制抑癌基因的表達(dá)，參與MM的發(fā)生。 第三部分 t(4；14)的MM的一個(gè)特點(diǎn)是高表達(dá)細(xì)胞周期蛋白D2，可能是染色體易位引起的，可能是骨髓瘤發(fā)病中的重要環(huán)節(jié)。在此部分中，設(shè)計(jì)并構(gòu)

6、建了針對(duì)cyclinD2的ShRNA表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)測(cè)序證實(shí)模板的正確插入。以陽(yáng)離子聚合物方法轉(zhuǎn)染LP1細(xì)胞株，轉(zhuǎn)染率為34.2％，RT-PCR可見(jiàn)轉(zhuǎn)染后cyclinD2的表達(dá)明顯降低，說(shuō)明對(duì)靶基因有明顯的抑制作用。LP1細(xì)胞轉(zhuǎn)染后出現(xiàn)了生長(zhǎng)曲線(xiàn)明顯低平，MTT方法檢測(cè)細(xì)胞增殖明顯受到抑制，細(xì)胞周期分析出現(xiàn)了S期細(xì)胞減少，G1期細(xì)胞增多，AnnexinV檢測(cè)，細(xì)胞出現(xiàn)了中度的凋亡，72小時(shí)的凋亡率為25.7±4.7％。說(shuō)明抑制cyclinD