補(bǔ)體活化產(chǎn)物C5a在三氯乙烯致敏小鼠腎臟損傷過(guò)程中的作用研究.pdf

1、研究背景：
　　三氯乙烯(TCE)是一種工業(yè)上廣泛使用的有機(jī)溶劑,由于使用量大且短期內(nèi)無(wú)法被禁止使用,從而導(dǎo)致暴露人群呈現(xiàn)升高趨勢(shì)。TCE主要通過(guò)皮膚和呼吸道進(jìn)入人體,造成機(jī)體多系統(tǒng)損傷。近年來(lái),在職業(yè)人群中發(fā)生的三氯乙烯藥疹樣皮炎(DMLT)引起職業(yè)衛(wèi)生領(lǐng)域的廣泛關(guān)注。三氯乙烯藥疹樣皮炎患者發(fā)生皮膚損傷的同時(shí)還存在肝腎損傷,并且肝腎損傷所導(dǎo)致的肝腎功能衰竭成為了 DMLT患者死亡的主要原因之一。因此,對(duì)于三氯乙烯所致的肝腎損傷機(jī)

2、制的研究在 DMLT患者的預(yù)防和治療工作中顯得尤為重要。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),補(bǔ)體系統(tǒng)的過(guò)度激活在三氯乙烯所致的免疫性肝腎損傷過(guò)程中發(fā)揮一定的作用,補(bǔ)體通過(guò)級(jí)聯(lián)反應(yīng)最終形成攻膜復(fù)合物(MAC),并且MAC能夠引起肝腎等臟器造成損傷。補(bǔ)體系統(tǒng)在激活的三種途徑中,除了最終形成攻膜復(fù)合物之外,均有過(guò)敏毒素C5a的產(chǎn)生。C5a與表達(dá)在細(xì)胞表面的受體結(jié)合,從而可以激發(fā)細(xì)胞脫顆粒,釋放組胺之類的活性介質(zhì),引起血管擴(kuò)張、通透性增加、平滑肌收縮以及支氣

3、管痙攣等癥狀。一些國(guó)內(nèi)外臨床研究表明,在一些腎臟疾病包括腎移植的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中都有 C5a的參與,所以對(duì)于補(bǔ)體活化產(chǎn)物 C5a在三氯乙烯所致的腎臟損傷過(guò)程中的作用研究對(duì)DMLT患者的防治有一定的實(shí)際意義。
　　研究目的：
　　通過(guò)檢測(cè)三氯乙烯致敏小鼠不同時(shí)點(diǎn)和不同組別小鼠腎臟中補(bǔ)體片段C5a沉積水平、受體C5aR的表達(dá)水平以及補(bǔ)體片段C5a與其受體C5aR的結(jié)合情況,并且結(jié)合腎功能和腎臟病理等指標(biāo),來(lái)探討補(bǔ)體片段C5a在三氯

4、乙烯致敏小鼠腎臟損傷過(guò)程中的作用。
　　研究方法：
　　選取6-8周健康雌性BALB/c小鼠113只,經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后隨機(jī)分成空白對(duì)照處理組、溶劑對(duì)照處理組、TCE處理組和C5aRA處理組(在TCE處理組模型基礎(chǔ)上另給予C5aR拮抗劑/C5aRA預(yù)處理)。建立BALB/c小鼠致敏模型,觀察并記錄小鼠背部受試部位皮膚致敏反應(yīng)情況。在末次激發(fā)后24 h對(duì)小鼠皮膚反應(yīng)情況進(jìn)行評(píng)分,并與24 h、48 h、72 h和7 d四個(gè)時(shí)點(diǎn)

5、收集小鼠血清,無(wú)菌取小鼠腎臟組織,并且根據(jù)評(píng)分情況將TCE處理組和C5aRA處理組小鼠分別分為致敏24h、48h、72h和7d組以及未致敏24h、48h、72h和7d組。采用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)各組血清中 Cr、BUN水平,HE染色法觀察小鼠腎臟病理變化。采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組小鼠腎臟中補(bǔ)體片段C5a的沉積以及受體C5aR的表達(dá)。免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)補(bǔ)體片段C5a與其受體C5aR的結(jié)合情況。
　　結(jié)果：
　　1.致敏情況

6、>　　在所有受試實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中,空白對(duì)照處理組和溶劑對(duì)照處理組小鼠背部皮膚受試部位均未見(jiàn)任何紅斑或水腫,50只TCE處理組小鼠中有21只小鼠背部皮膚受試部位出現(xiàn)不同程度的紅斑或水腫,51只C5aRA處理組小鼠中有26只小鼠背部皮膚出現(xiàn)不同程度的紅斑或水腫,致敏率分別是42％和51%,致敏強(qiáng)度為中度。
　　2.腎功能檢測(cè)結(jié)果
　　腎功能檢測(cè)結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組相比,溶劑對(duì)照組小鼠血清中Cr、BUN水平?jīng)]有明顯變化,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意

7、義(P>0.05)。與溶劑對(duì)照組相比,TCE致敏24 h、48 h和72 h組Cr水平明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),C5aRA致敏48 h和72 h組Cr水平明顯增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與TCE致敏48 h和72 h相應(yīng)時(shí)點(diǎn)比較,C5aRA致敏48 h和72 h組Cr水平明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與溶劑對(duì)照組相比,TCE致敏48 h和72 h以及C5aRA致敏72 h組BUN水平明顯升高,

8、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與TCE致敏48 h和72 h組相比,C5aRA致敏48 h和72 h組BUN,Cr水平明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),與TCE致敏7 d組相比,C5aRA致敏7 d組Cr水平明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　3.腎臟病理檢測(cè)
　　HE病理染色顯示,空白對(duì)照組小鼠腎臟沒(méi)有出現(xiàn)病理學(xué)改變,溶劑對(duì)照組小鼠腎臟與空白對(duì)照組小鼠腎臟相比,沒(méi)有明顯的病理學(xué)改變和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)

9、。與溶劑對(duì)照組小鼠腎臟相比,TCE致敏組小鼠腎臟中出現(xiàn)明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn),同時(shí)伴隨腎小球旁器畸形增生和腎小管形態(tài)學(xué)改變(包括腎小管結(jié)構(gòu)改變、腎小管上皮細(xì)胞溶解),并且在TCE致敏72 h組最為明顯。與溶劑對(duì)照組小鼠腎臟相比,C5aRA致敏組小鼠腎臟出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和腎小管系形態(tài)學(xué)改變,與TCE致敏組小鼠腎臟相比,C5aRA致敏組小鼠腎臟炎性細(xì)胞浸潤(rùn)以及腎小管和腎小球的損傷有明顯的減輕趨勢(shì)。
　　4.TCE處理組激發(fā)后補(bǔ)體片段C5a

10、的沉積以及受體C5aR的表達(dá)
　　免疫組化及評(píng)分結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組相比,溶劑對(duì)照組補(bǔ)體片段C5a的沉積沒(méi)有明顯的變化,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。TCE致敏24 h、48 h和72 h組小鼠腎臟中出現(xiàn)補(bǔ)體片段C5a的沉積,與溶劑對(duì)照組相比,TCE致敏24 h、48 h和72 h組的沉積水平顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與溶劑對(duì)照組相比,TCE致敏7 d組小鼠腎臟中補(bǔ)體片段C5a的沉積水平未出現(xiàn)明顯變化,差異

11、無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與空白對(duì)照組相比,溶劑對(duì)照組受體 C5aR表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與溶劑對(duì)照組相比,TCE致敏24 h、48 h和72 h組受體C5aR的表達(dá)水平出現(xiàn)明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與溶劑對(duì)照組相比,TCE致敏7 d組小鼠腎臟中C5aR的表達(dá)水平未出現(xiàn)明顯變化,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。所有TCE處理未致敏組均沒(méi)有補(bǔ)體片段C5a的過(guò)度沉積以及受體C5aR的

12、明顯表達(dá)。
　　5.C5aRA處理組激發(fā)后補(bǔ)體片段C5a的沉積以及受體C5aR的表達(dá)
　　免疫組化及評(píng)分結(jié)果顯示,與溶劑對(duì)照組相比,C5aRA致敏24 h、48 h和72 h組小鼠腎臟中補(bǔ)體片段C5a的沉積水平顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與溶劑對(duì)照組相比,C5aRA致敏7 d組小鼠腎臟中補(bǔ)體片段C5a的沉積水平未出現(xiàn)明顯變化,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與溶劑對(duì)照組相比,C5aRA致敏24 h、48 h

13、和72 h組小鼠腎臟中受體C5aR的表達(dá)水平明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與溶劑對(duì)照組相比,C5aRA致敏7 d組小鼠腎臟中受體C5aR的表達(dá)水平未出現(xiàn)明顯變化,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。C5aRA各時(shí)點(diǎn)致敏組小鼠腎臟中補(bǔ)體片段C5a的沉積水平和受體C5aR的表達(dá)水平與相應(yīng)TCE致敏各時(shí)點(diǎn)比較,補(bǔ)體C5a的沉積水平和受體C5aR的表達(dá)水平并未出現(xiàn)明顯的變化(P>0.05)。
　　6.TCE致敏組和C5aRA致

14、敏組小鼠腎臟中C5a與C5aR結(jié)合情況檢測(cè)
　　免疫熒光雙標(biāo)法顯示,未給予 C5aRA預(yù)處理的TCE致敏組小鼠腎臟中,C5aR發(fā)揮生物學(xué)作用,C5a與C5aR相結(jié)合,形成淺黃色的復(fù)合物。給予C5aRA預(yù)處理的C5aRA致敏組小鼠腎臟中,C5aR生物學(xué)作用被抑制,C5a與C5aR沒(méi)有結(jié)合形成復(fù)合物,C5a和C5aR出現(xiàn)在腎小管周圍不同部位,C5a沉積在腎小管外周,C5aR表達(dá)于腎小管內(nèi)圈。
　　結(jié)論：
　　1.TCE在一