KLF4與NOTCH1在脫氧膽酸誘導(dǎo)BARRETT食管形成過程的影響.pdf

1、背景與目的
　　BE(Barrett esophagus, BE)是食管粘膜發(fā)生柱狀上皮化生的病理現(xiàn)象,也是食管腺癌(Esophageal adenocarcinoma,EAC)重要的癌前病變。近年來,腺癌的發(fā)病率迅速增加且致死率高,BE作為其主要的危險(xiǎn)因素受到廣范重視。目前,對于反流性食管炎導(dǎo)致BE發(fā)生的細(xì)胞以及分子機(jī)制尚不清楚。BE的分子起源一直是研究的熱點(diǎn)問題,存在許多假說,都不能令人完全信服。
　　當(dāng)前,細(xì)胞重編程對

2、疾病發(fā)生發(fā)展的影響逐漸引起人們的關(guān)注。簡單來說它就是成熟細(xì)胞的逆向分化。IPS(Induced pluripotent stem cells)細(xì)胞就是通過基因重編程直接轉(zhuǎn)變?yōu)榕咛ジ杉?xì)胞樣的多潛能細(xì)胞,是細(xì)胞重編程的經(jīng)典案例。BE是柱狀上皮化生的現(xiàn)象,過去的研究證實(shí),膽酸處理可使正常的食管鱗狀上皮表達(dá)腸干細(xì)胞標(biāo)志物Cdx2,同時(shí)還表達(dá)Sox2、Bmp4等與細(xì)胞多潛能性有關(guān)的的細(xì)胞因子,由此,我們推測 BE是食管正常鱗狀上皮在胃食管反流物等

3、外界環(huán)境的刺激作用下經(jīng)過細(xì)胞重編程直接轉(zhuǎn)化為具有多潛能性的細(xì)胞,然后再進(jìn)一步分化為柱狀上皮而形成的。
　　Klf4,又稱作腸 Krüppel樣鋅指轉(zhuǎn)錄因子,它在體內(nèi)外的內(nèi)皮細(xì)胞均表達(dá)并且對于干細(xì)胞可塑狀態(tài)的維持也起十分重要的作用。Notch1是Notch信號通路的成員之一,該通路可以調(diào)控細(xì)胞的分化、增殖、凋亡等從而影響正常組織與細(xì)胞的生長,;同時(shí)它還參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展,如:乳腺癌,肝癌等。新近研究表明,Notch通路的活化在干

4、細(xì)胞自我更新以及分化過程中也發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用,是細(xì)胞多能性的標(biāo)志之一。本實(shí)驗(yàn)以永生化的正常食管鱗狀上皮細(xì)胞為材料,用脫氧膽酸進(jìn)行處理,模擬人體內(nèi)BE的生成環(huán)境,旨在研究膽酸處理食管正常細(xì)胞過程中,Klf4和Notch1的表達(dá)變化情況;以及正常人食管,食管炎和 BE組織標(biāo)本中兩者的表達(dá)情況,為闡明人類BE的發(fā)生提供全新的理論基礎(chǔ)。
　　研究方法:
　　1、人體標(biāo)本的收集以及免疫組化染色。
　　選取重慶市西南醫(yī)院2012

5、年3月至2012年12月的97例消化科門診患者,其中26例患者診斷為食管炎和22例為BE,分別制作組織標(biāo)本作為實(shí)驗(yàn)組;再選取49例正常人的食管制作組織標(biāo)本為對照組。采用免疫組織化學(xué)染色方法檢測所有標(biāo)本中Klf4和Notch1的蛋白表達(dá)水平,利用SPSS18.0軟件進(jìn)行對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,比較它們之間的關(guān)系。
　　2、培養(yǎng)永生化的正常食管鱗狀上皮細(xì)胞Het-1A,并用脫氧膽酸處理。
　　正常食管鱗狀上皮細(xì)胞Het-1A購自美

6、國ATCC菌種庫,以特殊上皮培養(yǎng)基培養(yǎng),在其過程中給予不同濃度(0μmol//l、100μmol/l、200μmol//l)的脫氧膽酸分別處理4、8、12小時(shí),觀察其生長狀況。
　　3、 RT-PCR以及Western blot檢測。
　　采用 RT-PCR以及 Western blot的方法檢測不同濃度膽酸以不同時(shí)間點(diǎn)處理后的Het-1A細(xì)胞表達(dá)Klf4和Notch1的mRNA和蛋白表達(dá)水平,用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)

7、行數(shù)據(jù)處理。
　　結(jié)果:
　　1、蛋白Klf4在BE組織中表達(dá)最強(qiáng),在食管炎組織中表達(dá)次之,在正常食管組織中表達(dá)最弱,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);蛋白Notch1在三種人體組織中均有表達(dá),但其表達(dá)率無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)
　　2、 Klf4的mRNA水平隨著脫氧膽酸處理的時(shí)間以及濃度呈線性升高,Notch1
　　的mRNA水平也隨著脫氧膽酸處理的時(shí)間以及濃度呈線性升高,各組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<

8、0.05)。與此同時(shí),Klf4和Notch1的蛋白表達(dá)與mRNA表達(dá)也呈相同趨勢,即隨著脫氧膽酸處理的時(shí)間以及濃度逐漸升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、Klf4在食管炎及BE組織標(biāo)本中表達(dá)逐漸增高,同時(shí)在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中它的mRNA和蛋白水平隨著脫氧膽酸處理的時(shí)間以及濃度升高,提示Klf4可能在BE的發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。
　　2、 Notch1在食管炎及BE組織標(biāo)本中表達(dá)與正常組織相比雖無明