肝缺血再灌注后HO-1 mRNA和蛋白的表達(dá)及其與細(xì)胞凋亡關(guān)系的臨床研究.pdf

1、目的：通過檢測肝組織在缺血再灌注后血紅素氧合酶-1(HemeOxygenase，HO-1)mRNA和HO-1蛋白的表達(dá)及細(xì)胞凋亡情況，探討肝組織對缺血再灌注的反應(yīng)及HO-1蛋白與肝細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系。為選用有效的預(yù)處理方法、抑制細(xì)胞凋亡、減輕肝臟缺血再灌注損傷(HepaticIschemic-ReperfusionInjury，HIRI)提供理論基礎(chǔ)。 方法： 1、標(biāo)本采集：在肝切手術(shù)中，分別肝門阻斷前、肝門阻斷開放同時

2、、手術(shù)結(jié)束關(guān)腹前取切緣旁2cm肝組織10g。分為兩份，一份用4％多聚甲醛固定，制作石蠟標(biāo)本。另一份置于-70℃冰箱中保存，用于提取總RNA。另外分別于肝切手術(shù)開始前、術(shù)后第一、四、七天取患者外周靜脈血5ml。 2、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測HO-1mRNA表達(dá)。 3、脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記技術(shù)(Terminal-deoynucleotidletransferasemediatedd-UT

3、Pnickendlabeling,TUNEL)法測定肝組織中肝細(xì)胞凋亡。 4、免疫組織化學(xué)法(S-P法)測定肝組織中HO-1蛋白的表達(dá)。 5、用自動生化分析測定血漿丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Alanineaminotrans-ferase，ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Aspartateinotransferase，AST)和血清總膽紅素(TotalBilirubin，TB)。 結(jié)果： 1、肝組織HO-1mRN

4、A的表達(dá)，在肝門阻斷前為0.2313±0.0575，肝門開放時為0.8168±0.1972，關(guān)腹前為1.2447±0.4403。這三個組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。肝門阻斷前HO-1mRNA的表達(dá)比肝門開放時減少，關(guān)腹前HO-1mRNA的表達(dá)要比肝門開放時增加。 2、肝細(xì)胞凋亡，在肝門阻斷前的凋亡指數(shù)(ApoptoticIndex，AI)為9.59±0.959‰，肝門開放時為5.80±0.939‰，關(guān)腹前為4.69±1

5、.738‰。肝細(xì)胞凋亡指數(shù)在這三個組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。肝門阻斷前的肝細(xì)胞凋亡指數(shù)高于肝門開放時和關(guān)腹前；而肝門開放時肝細(xì)胞凋亡指數(shù)高于關(guān)腹前。 3、HO-1蛋白的表達(dá)用陽性面積和累積光密度(IntegratedOpticalDensity，IOD)表示。在肝門阻斷前為63158.70±7444.44，肝門開放時為117552.10±18559.50，關(guān)腹前為146580.30±47256.92，這三個組間變化

6、的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。肝組織HO-1表達(dá)的IOD在肝門阻斷前9551.58±2508.77，肝門開放時為27665.29±4252.36，關(guān)腹前為33790.16±6574.92，這三個組間變化的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。肝組織中HO-1表達(dá)的陽性面積和IOD在關(guān)腹前比肝門開放時顯著增加，在肝門開放時比肝門阻斷前增加。 4、①ALT各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。ALT在術(shù)后第一天、第四天、第七

7、天都增加(p<0.05)，術(shù)后第一天ALT達(dá)到一個峰值，隨后逐漸下降。②AST各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，AST在術(shù)后第一天達(dá)到一個峰值，隨后逐漸下降。在術(shù)后第七天與手術(shù)前相比差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。③TB各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，在術(shù)后第一天逐漸升高，到術(shù)后第四天到達(dá)一個高峰，在術(shù)后第七天與術(shù)后第一天相比差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。 5、相關(guān)性分析：①肝門阻斷前肝組織中HO

8、-1mRNA的表達(dá)與肝組織HO-1蛋白的相關(guān)系數(shù)γ=0.986，p=0.000(p<0.05)；呈高度正相關(guān)。②肝門阻斷前肝組織HO-1mRNA的表達(dá)與肝細(xì)胞凋亡的相關(guān)系數(shù)γ=-0.961，p=0.000(p<0.05)；呈高度負(fù)相關(guān)。③肝門開放時肝組織HO-1mRNA的表達(dá)與肝組織HO-1蛋白的相關(guān)系數(shù)γ=0.985，p=0.000(p<0.05)；呈高度正相關(guān)。④肝門開放時肝組織HO-1mRNA的表達(dá)與肝細(xì)胞凋亡的相關(guān)系數(shù)Y=-0.

9、983，p=0.000(p<0.05)；呈高度負(fù)相關(guān)。⑤關(guān)腹前肝組織中HO-1mRNA的表達(dá)與肝組織HO-1蛋白的相關(guān)系數(shù)γ=0.996，p=0.000(p<0.05)；呈高度正相關(guān)。⑥關(guān)腹前肝組織HO-1mRNA的表達(dá)與肝細(xì)胞凋亡的相關(guān)系數(shù)γ=-0.962，p=0.000(p<0.05)；呈高度負(fù)相關(guān)。 結(jié)論： 1、在正常的肝組織中只有少量HO-1mRNA和HO-1蛋白的表達(dá)，肝臟受缺血再灌注損傷后，肝組織中HO-1m