羥基喜樹(shù)堿腦植入緩釋片的神經(jīng)毒性研究.pdf

1、背景:羥基喜樹(shù)堿(Hydroxycamptothecin,HCPT)是從珙桐科植物喜樹(shù)(Camptothecaacuminata Decne)中提取得到的一種吲哚類(lèi)生物堿,具有廣泛的抗腫瘤活性,且與其它抗腫瘤藥物無(wú)交叉耐藥性。HCPT可選擇性抑制拓樸異構(gòu)酶而干擾DNA的復(fù)制,為拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ特異性抑制劑。HCPT的抗癌作用與抗代謝藥及烷化藥不同,HCPT作用于S期細(xì)胞,為細(xì)胞周期性特異藥物。對(duì)S期的作用較G1,G2期明顯,對(duì)G0期細(xì)胞無(wú)作

2、用。在較高濃度時(shí)對(duì)核分裂有抑制作用,阻止細(xì)胞進(jìn)入分裂期。
　　 腦膠質(zhì)瘤(Glioma)是神經(jīng)外科難治性疾病之一,術(shù)后常易復(fù)發(fā),因此術(shù)后化療成為腦膠質(zhì)瘤輔助治療的重要手段。由于血腦屏障(blood brain barrier,BBB)的存在,多數(shù)化療藥物常規(guī)靜脈給藥后,難以在腦內(nèi)達(dá)到有效濃度,若加大給藥量又會(huì)導(dǎo)致全身性毒副作用的增加。近年來(lái),間質(zhì)化療在腦膠質(zhì)瘤治療領(lǐng)域引起了廣泛的關(guān)注,已成為腦膠質(zhì)瘤治療的重要手段。腦植入劑作為腦

3、部間質(zhì)化療的一種新型制劑,不僅可以使化療藥物避開(kāi)血腦屏障,直接作用于腫瘤組織,減少對(duì)正常組織的毒副作用,還具有緩控釋特性,使藥物能夠在病變部位較長(zhǎng)時(shí)間維持在有效治療濃度,取得了較好的臨床效果。
　　 本課題組前期采用聚乳酸(polylactic acid,PLA)為緩釋材料,研制了HCPT腦內(nèi)植入緩釋片,并對(duì)其治療大鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)X膠質(zhì)瘤的療效進(jìn)行了研究,顯示HCPT緩釋片腦內(nèi)植入治療能明顯延長(zhǎng)荷瘤大鼠的生存期。但HCPT腦內(nèi)植入緩釋片

4、植于腦內(nèi)后,在抑制腫瘤細(xì)胞增殖的同時(shí),對(duì)大鼠的毒性的大小,特別是對(duì)腦組織的損傷程度是決定是否對(duì)該制劑進(jìn)一步研究的重要因素,本實(shí)驗(yàn)擬對(duì)HCPT腦內(nèi)植入緩釋片的毒性進(jìn)行研究,為該制劑進(jìn)一步開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。
　　 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?
　　 (1)探討大鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法,并對(duì)其形態(tài)學(xué)進(jìn)行觀察;
　　 (2)HCPT緩釋片對(duì)體外培養(yǎng)大鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù),觀察是否具有細(xì)胞毒性作用;
　　 (3)在體考察

5、HCPT緩釋片對(duì)大鼠大腦組織結(jié)構(gòu)和功能的損傷:
　　 (4)在體考察HCPT緩釋片對(duì)大鼠心臟、肝臟、脾臟、肺以及腎臟組織的損傷;
　　 (5)在體考察HCPT緩釋片對(duì)大鼠骨髓的抑制作用。
　　 (6)在體考察HCPT緩釋片對(duì)胎鼠的致畸毒副作用及對(duì)胎鼠腦組織結(jié)構(gòu)的影響。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:
　　 (1)取新生SD乳大鼠的大腦皮層組織,采用胰酶消化、篩網(wǎng)過(guò)濾、離心等技術(shù)獲取大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞并進(jìn)行培養(yǎng);<

6、br>　　 (2)通過(guò)倒置顯微鏡、免疫細(xì)胞化學(xué)等方法對(duì)SD乳大鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行定性和定量鑒定;
　　 (3)采用CCK-8檢測(cè)HCPT對(duì)體外培養(yǎng)大鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞的毒性;
　　 (4)采用Hoechst33258染色檢測(cè)HCPT致體外培養(yǎng)大鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞凋亡的程度;
　　 (5)將不同劑量的HCPT緩釋片植入大鼠腦內(nèi),分別取30d和120d的實(shí)驗(yàn)大鼠,灌注后,取腦、心臟、肝臟、脾臟、肺以及腎臟組織,

7、通過(guò)石蠟切片、HE染色觀察各組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化:
　　 (6)分別對(duì)術(shù)后30d和120d實(shí)驗(yàn)大鼠腦組織標(biāo)本進(jìn)行Nissl染色,觀察神經(jīng)元胞漿內(nèi)尼氏體的數(shù)量,評(píng)價(jià)神經(jīng)元蛋白合成的能力;
　　 (7)分別對(duì)術(shù)后30d和120d實(shí)驗(yàn)大鼠腦組織標(biāo)本進(jìn)行TUNEL染色,觀察受損腦組織神經(jīng)元的凋亡比例;
　　 (8)取術(shù)后30d大鼠股骨骨髓,涂片后進(jìn)行瑞氏染色(wright's stain),觀察有核細(xì)胞的比例。
　　

8、 (9)將HCPT緩釋片植入孕鼠腦內(nèi),在分娩1d時(shí)取孕大鼠及胎鼠腦組織,通過(guò)神經(jīng)元體外原代培養(yǎng)、HE染色觀察腦組織神經(jīng)元的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化;
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 (1)經(jīng)形態(tài)學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)(NSE)鑒定所培養(yǎng)的大鼠大腦皮層神經(jīng)元并鑒定其純度大于95％;
　　 (2)CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示,①PLA對(duì)體外原代培養(yǎng)的大腦皮層神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)影響不明顯;②體外原代培養(yǎng)的大鼠大腦皮層神經(jīng)元經(jīng)以40μg/ml

9、HCPT處理24h后,與正常對(duì)照組比較,細(xì)胞活性顯著降低(P＜0.05);HCPT濃度達(dá)到320μg/ml時(shí),降低程度十分顯著(P＜0.01):③體外原代培養(yǎng)的大鼠大腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)20μg/ml HCPT處理24h后,與正常對(duì)照組比較,細(xì)胞活性顯著降低(P＜0.05);濃度達(dá)到80μg/ml時(shí),降低程度十分顯著(P＜0.01);④體外模擬HCPT緩釋片處理神經(jīng)細(xì)胞較單獨(dú)使用HCPT,對(duì)細(xì)胞的毒性更明顯。
　　 (3)Hoe

10、chst33258染色結(jié)果顯示,①PLA致體外原代培養(yǎng)大鼠大腦皮層神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡不明顯;②體外原代培養(yǎng)的大鼠大腦皮層神經(jīng)元經(jīng)80μg/ml HCPT處理24h后,與正常對(duì)照組比較,細(xì)胞活性顯著降低(P＜0.05);HCPT濃度達(dá)到160μg/ml時(shí),降低程度十分顯著(P＜0.01):③體外原代培養(yǎng)的大鼠大腦星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)40μg/mlHCPT處理24h后,與正常對(duì)照組比較,細(xì)胞活性顯著降低(P＜0.05);HCPT濃度達(dá)到80

11、μg/ml時(shí),降低程度十分顯著(P＜0.05);④體外模擬HCPT堿緩釋片處理神經(jīng)細(xì)胞較單獨(dú)使用HCPT,細(xì)胞凋亡比例無(wú)顯著差異。
　　 (4)經(jīng)大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn),大腦皮層組織免疫組化染色結(jié)果顯示,PLA對(duì)皮層組織神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)量和活性沒(méi)有顯著的影響;HCPT緩釋片對(duì)皮層組織神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)量和活性有一定的影響;低劑量HCPT緩釋片植入大腦皮層后,與假手術(shù)組比較,腦組織未見(jiàn)病理學(xué)改變;高劑量HCPT緩釋片對(duì)大腦皮層組織神經(jīng)元的數(shù)量和活性具

12、有顯著影響。
　　 (5)經(jīng)大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn),HE染色顯示,高劑量HCPT緩釋片對(duì)肝臟具有一定的損傷,出現(xiàn)肝水腫,而心臟、脾臟、肺以及腎臟組織未見(jiàn)病理學(xué)改變。
　　 (6)經(jīng)大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn),瑞氏染色顯示,未見(jiàn)HCPT緩釋片骨髓抑制。
　　 (7)經(jīng)神經(jīng)元體外原代培養(yǎng),模型組胎鼠神經(jīng)元體外發(fā)育良好,與正常對(duì)照組比較未見(jiàn)形態(tài)學(xué)差異;經(jīng)大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn),HE染色顯示,模型孕鼠腦組織有一定的炎癥反應(yīng),而胎鼠腦組織未見(jiàn)病理學(xué)改變。<

13、br>　　 結(jié)論:(1)采用無(wú)血清培養(yǎng)方法成功培養(yǎng)出了數(shù)量多、純度高的大腦皮層神經(jīng)元;(2)PI。A對(duì)體外原代培養(yǎng)的大鼠大腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞和大鼠大腦皮層神經(jīng)元毒性作用不顯著。(3)HCPT對(duì)體外原代培養(yǎng)的大鼠大腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞和大鼠大腦皮層神經(jīng)元均表現(xiàn)出一定的毒性作用,且對(duì)大鼠大腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞的毒性強(qiáng)于對(duì)大鼠大腦皮層神經(jīng)元的毒性;
　　 (4)經(jīng)大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn),PLA空白片對(duì)腦組織結(jié)構(gòu)和功能的損傷不顯著;