P120和IQGAP1在氣道上皮損傷修復(fù)過程中的作用研究.pdf

1、第一部分P120在脂多糖致氣道上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)中對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響實(shí)驗(yàn)背景氣道上皮是呼吸系統(tǒng)對(duì)抗有害刺激的第一道防線，各種病原微生物在機(jī)體抵抗力低下時(shí)均可引起肺部感染性疾病。其中以革蘭陰性菌細(xì)胞壁的主要成分脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）為主要致病因素，不僅引起肺部炎癥反應(yīng)，還可使原有肺部疾病發(fā)展和加重。氣道上皮在致病因素的攻擊下受到損傷，隨后啟動(dòng)自身修復(fù)機(jī)制。LPS致氣道上皮細(xì)胞損傷后，可促使細(xì)胞發(fā)生壞死

2、、凋亡和分泌前炎癥因子等反應(yīng)，這些反應(yīng)共同推動(dòng)肺損傷的發(fā)展過程。大量研究證明，核因子-κB（nuclear factor，NF-κB）信號(hào)途徑參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化、增殖、存活、凋亡及炎癥反應(yīng)過程中多種基因的轉(zhuǎn)錄，與LPS引起的肺損傷密切相關(guān)。然而，LPS導(dǎo)致肺部炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制還遠(yuǎn)未闡明。NF-κB在正常情況下與其抑制蛋白IκB結(jié)合以無活性的形式存在于靜息細(xì)胞胞漿中。外界刺激可引起IκB被迅速磷酸化、泛素化而降解，從而釋放NF-κB

3、活性亞單位轉(zhuǎn)位入核，激活下游靶基因轉(zhuǎn)錄。P120-catenin(p120)是連環(huán)素家族成員，可在細(xì)胞膜上與上皮鈣粘蛋白（E-Cadherin，E-Cad）相互結(jié)合而調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附。近年來有研究表明，p120通過調(diào)節(jié)NF-κB活性參與表皮炎癥反應(yīng)。我們推測(cè)在氣道炎癥反應(yīng)中，p120也可能通過NF-κB信號(hào)途徑發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。實(shí)驗(yàn)?zāi)康谋緦?shí)驗(yàn)使用脂多糖刺激建立體外氣道炎癥反應(yīng)模型，初步探討脂多糖刺激后氣道上皮細(xì)胞中p120的表達(dá)變化及其對(duì)NF-

4、κB信號(hào)通路的影響，從而進(jìn)一步分析氣道炎癥發(fā)生發(fā)展的機(jī)制。實(shí)驗(yàn)方法使用脂多糖刺激建立體外氣道炎癥反應(yīng)模型；采用免疫熒光共聚焦成像、Western blot、核漿分離方法檢測(cè)p120、NF-κB、IκBα等蛋白表達(dá)及定位變化；采用熒光定量PCR、定量酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)IL-8表達(dá)變化；采用熒光素酶報(bào)告基因分析的方法檢測(cè)NF-κB的活性；通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染及小干擾RNA技術(shù)改變細(xì)胞中p120的表達(dá)量再檢測(cè)p120對(duì)NF-κB信號(hào)途

5、徑的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果（1）細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染NF-κB報(bào)告質(zhì)粒后，報(bào)告基因分析結(jié)果顯示，LPS刺激可引起氣道上皮細(xì)胞中NF-κB信號(hào)的活化；同時(shí)熒光定量PCR和ELISA結(jié)果顯示NF-κB靶基因IL-8--一種前炎癥因子的表達(dá)亦有明顯增多。（2）p120在正常氣道上皮細(xì)胞中含量豐富，而LPS刺激后，其表達(dá)迅速下調(diào)，早在15 min時(shí)即可表現(xiàn)出來?；谝陨蟽牲c(diǎn)，我們推測(cè)在LPS所致氣道炎癥反應(yīng)中，p120與NF-κB信號(hào)途徑可能存在某種聯(lián)系。接下

6、來，我們先探討NF-κB信號(hào)活化的機(jī)制。（3）實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在LPS刺激15 min～30 min時(shí)，NF-κB的抑制蛋白IκBα迅速降解至幾近消失；其磷酸化形式在正常細(xì)胞中幾乎檢測(cè)不到，但在LPS處理15 min～30 min這段時(shí)間內(nèi)含量顯著增加，在IκBα恢復(fù)正常水平后，p-IκBα又再次消失不見。（4）核漿分離試驗(yàn)及免疫熒光共聚焦結(jié)果均顯示LPS促使NF-κB活性亞單位p65發(fā)生核內(nèi)轉(zhuǎn)位。結(jié)果（3）和（4）表明，LPS在氣道上皮細(xì)胞

7、中引起的NF-κB活化是通過使IκBα發(fā)生磷酸化降解，從而導(dǎo)致p65由NF-κB/IκB復(fù)合體中釋放并轉(zhuǎn)位入核激活相應(yīng)靶基因轉(zhuǎn)錄。接下來，我們通過對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染p120質(zhì)?；蛐「蓴_RNA，研究p120對(duì)NF-κB信號(hào)活化的影響。（5）實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)p120可以部分抑制NF-κB的活性及IL-8的表達(dá)，但免疫熒光及核漿分離結(jié)果依然可以觀測(cè)到p65核轉(zhuǎn)位。（6）小干擾RNA敲低p120的表達(dá)后，免疫熒光結(jié)果顯示，LPS可引起p65更強(qiáng)烈的

8、核染色；同時(shí)核漿分離產(chǎn)物的免疫印跡結(jié)果也證實(shí)阻斷p120表達(dá)可進(jìn)一步促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的p65核轉(zhuǎn)位。（7）阻斷p120的表達(dá)可大大提升NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性及其靶基因IL-8的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)論本實(shí)驗(yàn)表明：（1）LPS可導(dǎo)致氣道上皮細(xì)胞中p120表達(dá)下調(diào)。（2）LPS可誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞NF-κB信號(hào)的活化及其靶基因IL-8的表達(dá)。（3）NF-κB信號(hào)途徑的活化是通過IκBα的磷酸化降解釋放p65入核實(shí)現(xiàn)的。（4）過表達(dá)p120可部分抑制NF-κ

9、B信號(hào)的活化；敲低p120能顯著促進(jìn)NF-κB信號(hào)的活化。本實(shí)驗(yàn)提示：在LPS引起的氣道炎癥反應(yīng)中，p120可能負(fù)性調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)途徑的活化，從而抑制氣道炎癥反應(yīng)。第二部分 IQGAP1在吸煙致氣道上皮損傷修復(fù)中對(duì)細(xì)胞粘附的影響實(shí)驗(yàn)背景
　　 大量研究表明，吸煙可從多個(gè)方面損傷氣道上皮細(xì)胞，更是導(dǎo)致慢性阻塞性肺疾?。–OPD）和支氣管源性肺癌發(fā)生發(fā)展的確切因素。然而，吸煙致氣道上皮損傷的具體機(jī)制仍未完全闡明。上皮細(xì)胞損傷后，

10、立即啟動(dòng)自我修復(fù)過程。這是一個(gè)步驟繁雜的過程，包括細(xì)胞延伸、遷移和增殖。而細(xì)胞間粘附的改變表現(xiàn)在損傷修復(fù)的初始階段，因此對(duì)細(xì)胞粘附的研究顯得非常有意義。已有研究證實(shí)，IQGAP1參與許多生命活動(dòng)，是一個(gè)多功能蛋白。作為Rho家族GTPases成員Rac1和Cdc42的一個(gè)重要的效應(yīng)因子，IQGAP1不僅參與調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架，影響細(xì)胞粘附、極化和遷移，還可能介導(dǎo)β-catenin/TCF信號(hào)的轉(zhuǎn)錄活化，從而引起其下游細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)。有

11、研究顯示IQGAP1可能通過β-catenin調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附，然而具體機(jī)制并不明了。由于IQGAP1可與作為細(xì)胞粘附成分和Wnt信號(hào)通路成員的β-catenin結(jié)合，因此研究IQGAP1在損傷修復(fù)中的作用就顯得尤為重要。有報(bào)導(dǎo)指出，IQGAP1在肺組織中高表達(dá)。我們推測(cè)IQGAP1在氣道上皮損傷修復(fù)中可能發(fā)揮作用，并探討其可能機(jī)制。實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^建立香煙煙霧提取物（CSE）損傷氣道上皮的體外模型，觀察IQGAP1在損傷修復(fù)過程中的表達(dá)及定位

12、變化及其對(duì)細(xì)胞粘附復(fù)合體成員β-catenin的影響，初步研究其對(duì)氣道上皮損傷修復(fù)中細(xì)胞粘附改變的影響，并為進(jìn)一步探討細(xì)胞增殖修復(fù)提供依據(jù)。實(shí)驗(yàn)方法使用CSE建立體外氣道上皮損傷模型，首先使用相差顯微鏡觀察氣道上皮細(xì)胞在CSE刺激下的形態(tài)學(xué)變化，同時(shí)采用MTT方法檢測(cè)不同濃度下細(xì)胞活力的變化。接著應(yīng)用Western blot、免疫熒光共聚焦成像、免疫沉淀等技術(shù)觀察CSE刺激后IQGAP1的表達(dá)、定位變化及其對(duì)細(xì)胞粘附復(fù)合體的影響。最后通

13、過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染野生型IQGAP1和小干擾RNA，采用核漿分離等方法檢測(cè)過表達(dá)或敲低IQGAP1對(duì)β-catenin的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果（1）在相差顯微鏡下觀察，可見培養(yǎng)的氣道上皮細(xì)胞呈現(xiàn)上皮細(xì)胞典型的鋪路石狀形態(tài)，立體感強(qiáng)，微凸起，細(xì)胞間連接緊密。在CSE損傷后，細(xì)胞伸展扁平，細(xì)胞間間隙增寬，伸出突起相接觸，更高濃度的CSE致使細(xì)胞皺縮變圓，死亡增加。（2）MTT結(jié)果顯示，低濃度CSE可促進(jìn)細(xì)胞增殖，而高濃度則引起細(xì)胞活力降低。（3）采用Wes

14、tern blot和免疫熒光技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)，CSE促使氣道上皮細(xì)胞中IQGAP1呈現(xiàn)時(shí)間依賴性過表達(dá)，且其定位信號(hào)由細(xì)胞連接處擴(kuò)散至整個(gè)胞漿。更為有意義的是，我們通過免疫熒光和免疫印跡發(fā)現(xiàn)IQGAP1可與β-catenin結(jié)合，CSE刺激后，這種結(jié)合變得更強(qiáng)，而β-catenin與α-catenin的結(jié)合銳減。（4）進(jìn)一步通過使用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)IQGAP1過表達(dá)不僅可以增加β-catenin在細(xì)胞內(nèi)聚集，還可以促使積聚的β-ca

15、tenin轉(zhuǎn)位入核。而用干擾RNA阻斷IQGAP1的表達(dá)后，β-catenin在胞漿內(nèi)的聚集減少，其入核也受到影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)論本實(shí)驗(yàn)表明：（1）CSE可在體外誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞過表達(dá)IQGAP1。（2）CSE減弱β-catenin與粘附復(fù)合體中α-catenin的結(jié)合，但加強(qiáng)其與IQGAP1的結(jié)合（3）過表達(dá)IQGAP1促使β-catenin在胞漿中積聚并進(jìn)而轉(zhuǎn)位入核。本實(shí)驗(yàn)提示：IQGAP1通過與α-catenin競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合β-cateni