多功能蛋白GSK3β與IQGAP1在氣道上皮毒性損傷過程中的作用研究.pdf

1、本研究分為二部分：
　　 第一部分：博萊霉素致氣道上皮細(xì)胞毒性損傷中GSK3β的活性變化對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響實(shí)驗(yàn)
　　 博萊霉素是一種有效的化療藥物，但所引起的急性肺損傷與肺纖維化的副作用卻不容忽視。氣道上皮是呼吸系統(tǒng)對(duì)抗毒性刺激的第一道防線，因此氣道上皮細(xì)胞通常被認(rèn)為是博萊霉素肺毒性的主要靶點(diǎn)。暴露于博萊霉素的細(xì)胞可發(fā)生各種細(xì)胞反應(yīng)，包括細(xì)胞凋亡、細(xì)胞壞死及前炎癥因子分泌等，這些細(xì)胞反應(yīng)共同促進(jìn)了博萊霉素導(dǎo)致的肺

2、損傷與肺纖維化的發(fā)展過程。大量研究顯示，核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號(hào)參與調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、細(xì)胞分化、增殖、凋亡及炎癥過程的多種基因的轉(zhuǎn)錄，與博萊霉素引起的肺毒性密切相關(guān)。
　　 正常情況下，NF-κB與抑制蛋白IκB相結(jié)合并隱匿于靜息細(xì)胞的胞漿，保持無(wú)活性的狀態(tài)。外界刺激可引起IκB進(jìn)入泛素化降解途徑從而使NF-κB被釋放并轉(zhuǎn)位入核，激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。糖原合成酶激酶3（glycogen sy

3、nthase kinase 3,GSK3）是一種多功能的絲/蘇氨酸蛋白激酶，與NF-κB不同，GSK3β在靜息細(xì)胞內(nèi)呈組成性激活的狀態(tài)，其N末端絲氨酸殘基可發(fā)生PI3K（phosphatidylinositol3-kinase）/Akt（also called protein kinase B，PKB）依賴性的磷酸化并導(dǎo)致其活性抑制。近年來(lái)的研究顯示，GSK3β可能參與調(diào)節(jié)與NF-κB信號(hào)相關(guān)的多種疾病的病理生理過程，但具體機(jī)制并不明確

4、。因此，本研究針對(duì)GSK3β在博萊霉素肺毒性中的活性變化及其對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響進(jìn)行了初步探討。
　　 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br>　　 本實(shí)驗(yàn)使用博萊霉素刺激建立體外肺毒性損傷模型，初步探討在博萊霉素作用下氣道上皮細(xì)胞中GSK3β的活性變化對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響，從而進(jìn)一步分析肺纖維化發(fā)生發(fā)展的機(jī)制。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 使用博萊霉素刺激建立體外肺毒性損傷模型，首先采用相差顯微鏡及細(xì)胞熒光染色觀察氣道上皮

5、細(xì)胞在博萊霉素刺激下的形態(tài)變化，并進(jìn)一步使用MTT方法檢測(cè)不同濃度下細(xì)胞活力的變化。然后使用Western blot、免疫熒光共聚焦成像、核漿分離、免疫共沉淀、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染及報(bào)告基因分析等方法觀測(cè)博萊霉素處理后NF-κB信號(hào)的活化狀態(tài)、Akt/GSK3β通路的活性變化及其對(duì)NF-κB信號(hào)的影響。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 相差顯微鏡下觀察顯示培養(yǎng)的氣道上皮細(xì)胞呈現(xiàn)上皮細(xì)胞典型的鋪路石狀形態(tài)，其特點(diǎn)是立體的，稍微凸起的，細(xì)胞間緊

6、密連接。經(jīng)博萊霉素毒性刺激后，細(xì)胞間隙增寬，伸展扁平，立體感消失，死細(xì)胞增多，在熒光顯微鏡下可見大量細(xì)胞核呈現(xiàn)皺縮變圓、亮藍(lán)色的凋亡形態(tài)。MTT結(jié)果顯示博萊霉素可引起濃度依賴性的細(xì)胞活力降低。
　　 然后，我們使用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染及報(bào)告基因分析方法發(fā)現(xiàn)博萊霉素可引起氣道上皮細(xì)胞中NF-κB信號(hào)的活化，而且在博萊霉素刺激2 h時(shí)，NF-κB的抑制蛋白IκBα迅速發(fā)生降解并幾近消失，同時(shí)核漿分離實(shí)驗(yàn)及免疫熒光共聚焦結(jié)果均顯示NF-κB亞單位

7、p65發(fā)生了向核內(nèi)的轉(zhuǎn)位，與文獻(xiàn)所報(bào)道的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相符。接著我們發(fā)現(xiàn)，博萊霉素刺激以后，Akt與GSK3β發(fā)生了明顯的磷酸化，而使用抑制劑LY294002抑制二者的磷酸化以后，NF-κB信號(hào)的活性也隨之降低。因此我們推測(cè)，博萊霉素所引起的NF-κB信號(hào)的活化必與GSK3β的活化狀態(tài)有著密切的關(guān)系。于是我們進(jìn)一步使用持續(xù)激活型GSK3βS9A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入細(xì)胞后再使用博萊霉素刺激，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GSK3β的持續(xù)活化抑制了博萊霉素誘導(dǎo)的NF-κB

8、信號(hào)活化，并保護(hù)內(nèi)源性IκBα不受降解，繼而阻止了NF-κB亞單位p65轉(zhuǎn)位入核。為了更深入的探究這種現(xiàn)象的可能原因所在，我們使用免疫共沉淀的方法將GSK3β與IκBα互相沉淀，發(fā)現(xiàn)二者可以共同沉淀下來(lái)，并在博萊霉素刺激后共同沉淀的蛋白減少，而在沉淀的IκBα蛋白中并未檢測(cè)到磷酸化的GSK3β，提示GSK3β與IκBα存在于同一個(gè)復(fù)合物中，并且很有可能對(duì)IκBα有著某種機(jī)制的保護(hù)作用，進(jìn)一步說明GSK3β可能通過與IκBα的這種相互作用

9、從而影響了博萊霉素誘導(dǎo)的NF-κB信號(hào)活化。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)論：
　　 本實(shí)驗(yàn)表明：(1)博萊霉素可導(dǎo)致氣道上皮細(xì)胞發(fā)生形態(tài)學(xué)改變及細(xì)胞活力降低。(2)博萊霉素可誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞NF-κB信號(hào)的活化。(3)博萊霉素誘導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞中Akt及GSK3β的磷酸化可能參與了NF-κB信號(hào)的活化。(4)GSK3β的活性改變可能通過與NF-κB抑制蛋白IκBα的相互作用從而負(fù)向調(diào)節(jié)博萊霉素誘導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞中NF-κB信號(hào)的活化過

10、程。
　　 第二部分：甲醛暴露致氣道上皮毒性損傷中IQGAP1的表達(dá)變化對(duì)APC蛋白及β-catenin/Tcf信號(hào)通路的影響
　　 甲醛（formaldehyde，F(xiàn)A）是一種常見的化學(xué)污染物，不論是動(dòng)物還是人體，長(zhǎng)期低劑量的接觸均可引起慢性中毒性呼吸道疾病，甚至誘導(dǎo)基因突變并提高機(jī)體罹患各種惡性腫瘤的幾率。
　　 目前已證實(shí)，IQGAP1在多種疾病及腫瘤組織中均存在過表達(dá)的現(xiàn)象，但其中具體機(jī)制并不明確。IQG

11、AP1是Rho家族GTPases成員Rac1和Cdc42的一個(gè)重要的效應(yīng)因子，具有多個(gè)蛋白結(jié)合位點(diǎn)，不僅參與調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架，影響細(xì)胞黏附，而且還可能介導(dǎo)β-連環(huán)素/Tcf信號(hào)的轉(zhuǎn)錄活化，從而引起其下游細(xì)胞增殖相關(guān)基因（如cyclin D1和c-myc等）的表達(dá)。另一方面，活化的Rac1和Cdc42可與IQGAP1相結(jié)合并促使結(jié)腸腺瘤性息肉病蛋白（adenomatous polyposis coli，APC）在遷移細(xì)胞前緣（leading

12、edge）穩(wěn)定微管正極末端，從而參與細(xì)胞極化和定向遷移。然而近年大量研究發(fā)現(xiàn)，APC也可存在于核內(nèi)，不僅作用于紡錘體，還可以通過抑制β-連環(huán)素/Tcf信號(hào)進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。因此，本研究通過建立甲醛毒性暴露的體內(nèi)外模型以觀察IQGAP1在氣道上皮損傷修復(fù)中的動(dòng)態(tài)變化，并使用轉(zhuǎn)染及RNA干擾等技術(shù)進(jìn)一步在體外實(shí)驗(yàn)中研究IQGAP1對(duì)APC蛋白及β-連環(huán)素/Tcf信號(hào)的影響，以期了解甲醛暴露后氣道上皮損傷修復(fù)的過程，為闡明甲醛可能的致瘤性機(jī)制

13、提供一個(gè)新的思路。
　　 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br>　　 建立甲醛毒性暴露的體內(nèi)、外模型，觀察IQGAP1在氣道上皮損傷修復(fù)中的動(dòng)態(tài)變化，并使用免疫熒光、免疫共沉淀、轉(zhuǎn)染及RNA干擾等技術(shù)進(jìn)一步在體外實(shí)驗(yàn)中研究IQGAP1對(duì)APC蛋白及β-連環(huán)素/Tcf信號(hào)的影響，以期了解甲醛暴露后氣道上皮損傷修復(fù)的過程，為闡明甲醛可能的致瘤性機(jī)制提供一個(gè)新的思路。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 使用甲醛毒性暴露建立體內(nèi)、外氣道上皮損傷模型

14、，首先采用HE染色在普通顯微鏡下觀察小鼠氣道上皮染毒后的病理變化，并同時(shí)使用免疫熒光共聚焦及免疫印跡技術(shù)檢測(cè)IQGAP1在小鼠肺組織內(nèi)的定位與表達(dá)變化。體外實(shí)驗(yàn)中，相差顯微鏡及MTT方法觀察氣道上皮細(xì)胞在甲醛暴露下的形態(tài)變化及IQGAP1對(duì)細(xì)胞增殖的影響，pull down方法檢測(cè)Rac1及Cdc42的活性，免疫熒光共聚焦分析APC蛋白的亞細(xì)胞定位，使用RNA干擾、Western blot、核漿分離、免疫共沉淀、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染及報(bào)告基因分析等

15、方法觀測(cè)甲醛暴露后IQGAP1的表達(dá)變化及其對(duì)APC蛋白和β-連環(huán)素/Tcf信號(hào)的影響。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 在甲醛吸入染毒過程中，小鼠氣道上皮經(jīng)歷了從細(xì)胞壞死脫落、纖毛倒伏、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)到纖毛重現(xiàn)、基底細(xì)胞增生、細(xì)胞層次增加的損傷修復(fù)的動(dòng)態(tài)過程。
　　 IQGAP1的表達(dá)隨著損傷修復(fù)過程的進(jìn)展呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，并在損傷嚴(yán)重時(shí)大量聚集于胞漿中，而在修復(fù)末期重新定位于漿膜面，暗示IQGAP1在小鼠經(jīng)歷甲醛

16、毒性刺激時(shí)發(fā)揮了重要作用。
　　 另外，在相差顯微鏡下觀察可見培養(yǎng)的氣道上皮細(xì)胞在甲醛暴露后失去其特有的鋪路石狀形態(tài)，細(xì)胞間隙增寬，伸展扁平，更高濃度時(shí)細(xì)胞皺縮變圓，死細(xì)胞明顯增多。MTT結(jié)果顯示低濃度甲醛可促進(jìn)細(xì)胞增殖，而高濃度甲醛則引起細(xì)胞活力降低并呈濃度依賴性。接著，我們使用pull down方法檢測(cè)Rho家族蛋白R(shí)ac1及Cdc42的活性，發(fā)現(xiàn)二者在甲醛暴露后的活性存在不一致的變化趨勢(shì)（Cdc42活性降低，Rac1活性先

17、升后降），可能在損傷修復(fù)過程中發(fā)揮著不同的作用。然后，我們進(jìn)一步檢測(cè)其效應(yīng)因子IQGAP1在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)與定位，Western blot結(jié)果顯示甲醛可誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞中IQGAP1呈時(shí)間-濃度依賴性的過表達(dá)，其定位信號(hào)也從細(xì)胞連接處及核周擴(kuò)散至整個(gè)胞漿。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)論：
　　 本實(shí)驗(yàn)表明：(1)甲醛暴露能在體內(nèi)、外誘導(dǎo)IQGAP1過表達(dá)。(2)IQGAP1過表達(dá)可通過增加β-連環(huán)素在細(xì)胞內(nèi)的聚集及向核內(nèi)轉(zhuǎn)位，從而促進(jìn)β